秦晓庆，赵树臣，侯振中

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

空肠弯曲杆菌（C.jejuni）是一种在世界范围内受到广泛重视的人畜共患病的病原（Tauxe，1992），该菌生长条件苛刻，使得在分离和实验室维持培养的过程具有一定的难度。而关于该菌虽具极敏感的特性，却依然能在环境中存活并致病的原因，目前仍使人困惑。近年来，有研究发现C.jejuni能够形成一种被称之为“生物膜”的聚集体［1－2］。细菌生物膜是一种特殊的菌体生存和生长的方式，它能够保护菌体细胞免受不良环境的伤害，如紫外线、吞噬以及干燥［3］。

本试验从建立该菌的体外生物膜模型入手，采用结晶紫染色以及光镜和扫描电镜的方法对其进行鉴定，用正交法对3种环境因素对该菌生物膜形成的影响进行研究，希望掌握其规律及特性，为该菌生物膜形成的阻断和消除提供有价值的信息。

1 试验材料

1.1 试验菌落C.jejuni临床分离株，分离菌株的病料采集于哈尔滨市某屠宰场。

1.2 培养基试剂及仪器 改良的Camp－BAP分离培养基、布氏增菌肉汤；PCR Master Mix、DNA Marker、Taq酶、电泳用琼脂糖、EB；结晶紫染液，乙醇，戊二醛，四氧化锇，乙酸异戊酯等；超净工作台、厌氧培养罐、电热恒温培养箱、水套二氧化碳培养箱、紫外可见分光光度计、倒置荧光显微镜、扫描电镜等。

2 试验方法

2.1 细菌的分离与鉴定

2.1.1 细菌的分离 将样本划线接种于改良的Camp－BAP培养基上，接种后的平板微需氧条件、42℃恒温培养箱中培养48h～72h［4］。分离到的细菌经过2～3次选择培养基纯化。

2.1.2 病原菌的鉴定 挑取疑似菌落涂片并进行革兰染色，置于显微镜下进行形态学观察。初步确定为空肠弯曲杆菌后，对其进行相应的生化鉴定和PCR鉴定。

常规生化检测，参照国家标准SN0175－92以及GB/T 4789.28－2003判定；PCR检测的具体方法均参考朱建国等［5］所建立的用于C.jejuni的快速PCR鉴定的方法，该方法对C.jejuni可以特异的扩增出516bp条带，上述流程中所涉及的引物合成及电泳产物的测序等均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

2.2C.jejuni生物膜体外模型建立及鉴定

2.2.1C.jejuni生物膜形成能力的分析 布氏肉汤增菌，微需氧，42℃培养48h～72h，得到C.jejuni浓菌液，无菌布氏肉汤调整菌液浓度至OD600＝0.2。取上述菌液5mL接种于含20mL无菌布氏肉汤的锥形瓶中。将聚苯乙烯片（2×2cm）作为生物膜载体放置到锥形瓶中［6］。

设试验组和空白对照组（即不接种菌液），42℃厌氧静置培养5d，每隔1d取出3个样本，肉眼观察是否有膜样物质附着，结晶紫染色后置于电镜和扫描电镜下观察。

2.2.2C.jejuni生物膜模型的鉴定 样本经1%结晶紫染色后需经过光学显微镜（×400）以及扫描电镜（SEM）鉴别是否建模成功。其中，扫描电镜样本处理步骤如下所示［7］：

（1）25mL/L的戊二醛溶液于4℃固定24h，PBS冲洗；（2）1mL/L的四氧化锇溶液4℃固定4 h，PBS冲洗；（3）300、500、700、800、900mL/L 和100mL/L乙醇梯度脱水；（4）乙酸异戊酯置换，临界点干燥仪内干燥4h；（5）真空喷金；（6）扫描电镜观察并拍照。

2.3 正交法检测环境因素对C.jejuni生物膜形成的影响 增菌并调整浓度为OD600＝0.2±0.01。按照L9（34）设计正交试验，正交试验因素及水平见表1。

表1 正交实验因素及水平

C.jejuni生物膜形成的水平采用结晶紫法进行检测，步骤如下［8］：（1）试管法培养C.jejuni生物膜5d；（2）无菌PBS冲洗3次；（3）3%戊二醛固定20min后，37℃烘干；（4）1%结晶紫染色30min，弃去染液，去离子水冲洗，干燥；（5）20%丙酮－乙醇溶液溶解。紫外分光光度计测OD600值，取均值。

3 试验结果

3.1 菌株的分离及鉴定 划线培养后得到疑似C.jejuni的菌落，菌落扁平、灰色不闪光、半透明、白色、棕黄色凸起、边缘不整齐、有时沿接种线扩散。革兰染色阴性，光学显微镜下呈现出与C.jejuni相吻合的形态学特征，例如小逗点状，或者两菌体相连呈现出S形、海鸥形或螺旋状。

对菌株进行常规的生化鉴定和PCR鉴定，结果12个样本中分离的菌株有6株与C.jejun的生化特性相符，进一步进行PCR鉴定的结果为：生化鉴定的6株C.jejuni阳性菌中有2株得到了特异性片段，该片段长度为516bp［5］。PCR产物测序进一步证实了该2株菌为C.jejuni。

3.2C.jejuni生物膜体外模型的建立结果 经过5d的静置培养，可见该菌能在载体上形成肉眼可见的膜状物，而空白对照组的载体上则没有膜状附着，初步断定该菌具有生成生物膜的能力。

染色后，将载体置于油镜下（×400）可以观察到从菌体聚集到逐步形成片状，最后形成膜状覆盖在载体上的过程，初步断定建模成功（见中插彩版图1）。扫描电镜观察，可以从更微观的层次观察到菌体相互间连接、粘附、聚集直至形成团状或是片状的过程，见图2。

3.3 环境因素对C.jejuni生物膜形成的影响 环境因素对C.jejuni生物膜形成的影响，通过正交试验后结果如表2所示。从表2中可以看出，3种因素中，对该菌生物膜形成影响从大到小依次是空气条件、温度、培养基（RA＞RC＞RB）。而同一因素处于不同水平时，生物膜的形成也有所差异，综上，可得出C.jejuni生物膜形成的最佳条件为A2，B1，C3，即在常规的空气条件下，37℃，MHB培养基，该菌的生物膜形成最为理想。

4 讨论

生物膜的形成是细菌对抗抗生素和机体免疫系统的一种手段，也是感染由急性转为慢性或持续性感染的原因之一［9］。C.jejuni是一种世界范围内普遍存在的人畜共患病的病原，对各种动物均可感染，猪感染本病的主要症状为腹泻，因此本试验选取有腹泻症状的猪作为采样对象，具有一定的现实意义和可行性。对于环境因素对该菌生物膜的影响方面，Reuter［3］和 Reeser［2］曾提出有氧的环境更容易促进C.jejun生物膜的形成，而 Fields［11］、Mclennan［12］也分别报道了营养丰富并不利于该菌生物膜的形成，上述结论都在本试验中得到了验证。分析C.jejuni临床株形成生物膜的能力，观察生物膜从粘附到成熟的过程并研究其影响因素，对于进一步研究对生物膜形成的阻断或清除，进而用于对该菌耐药性的消除具有重要的意义。

图2 扫描电镜观察生物膜形成的过程 （a→b→c）

表2 正交试验

然而，生物膜形成的机制非常复杂，体外模型的建立只能作为生物膜形成的简单模拟，要想进一步了解该病原菌生物膜的形成机制以及其在细菌耐药性方面的作用原理上还需要更大量的研究。

［1］ Buswell C M，Herlihy Y M，Lawrence L M.Extended survival and persistence of Campylobacter spp.in water and aquatic biofilms and their detection by immunofluorescent－an －tibody and－rRNA staining［J］.Appl Environ Microbiol，1998，64：733－741.

［2］ Ryan J，Reeser Robert T，Medler Stephen J.Billington.Characterization of Campylobacter jejuni Biofilms under Defined Growth Conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（6）：1908－1913.

［3］ Mark Reuter，Arthur Mallett，Bruce M.Biofilm Formation byCampylobacterjejniIs Increased under Aerobic Conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76（7）：2122－2128.

［4］ 朱建国，侯建军，姜毅，等.空肠弯曲杆菌的微需氧分离培养办法.上海交通大学，200810202320［P］.2009－03－25.

［5］ 朱建国，侯建军，华修国，等.空场弯曲杆菌的聚合酶链式检测反应，上海交通大学：200810042787［P］.2009－01－28.

［6］ Teixeiraa P，Lopesb Z，Azeredoa J，etal.Physico－chemical surface characterization of a bacterial population isolated from a milking machine Food Microbiol，2005，22：247－251.

［7］ 胡锦松，陈豪泰，张杰，等.细菌生物膜鉴定方法的研究进展［J］.中国兽医科学，2010，40（11）：1194－1199.

［8］ Tauxe RV.Epidemiology ofCampylobacterjejuniinfections in the United States and other industrial nations.In：Nachamkin I，Blaser M J，Tompkins L S，editiors.Campylobacter jejuni：current and future trends［J］.Washington：American Society for Microbiology，1992，9－12.

［9］ 李静，马勋.粪肠球菌生物膜的形成及影响因素［J］.中国预防兽医学报，2008，30（7）：523－526.

［10］阳成波，蒋原.空肠弯曲杆菌感染流行病学研究进展［J］.动物医学进展，2002，23（6）：10－13.

［11］Fields J A，Thompson S A.Campylobacter jejuni CsrA mediates oxidative stress responses，biofilm formation，and host cell invasion［J］.Bacteriol，2008，190：3411－3416.

［12］Mclennan M K，Ringoir D D.Campylobacter jejuni biofilms up－regulated in the absence of the stringent response utilize a calcofiuor white－reactive polysaccharide ［J］.J Bacteriol，2008，190（3）：1097－1107.