王 婷，欧 敏，黄友章

中国人民解放军海军总医院干部呼吸科 北京100048

大量研究[1-2]表明，低氧造成的肺血管内皮细胞功能紊乱和平滑肌收缩是发生肺动脉高压的主导因素。肺血管内皮细胞不仅是血管内壁的屏障，而且分泌释放多种生物活性物质调节血管张力和平滑肌增殖，参与凝血剂抗血栓形成，影响血管通透性和物质交换。其中，内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是内皮细胞分泌的最强的血管收缩因子，而内皮源性舒张因子主要为一氧化氮(nitric oxide，NO)和花生四烯酸代谢产物前列环素(prostacyclin，PGI2)。益肺活血复方是董建华院士临床治疗肺心病的一组中药复方，既往研究[3-4]表明，在动物实验水平上，益肺活血复方可抑制中膜增厚、减轻血管缩窄、降低肺动脉高压。临床上低氧常伴有二氧化碳的增高，因此该实验采用体外低氧高二氧化碳环境下培养的人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)，研究益肺活血复方对HPAECs微结构及分泌ET-1、NO及PGI2的影响，从而探讨其在肺动脉高压治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1动物与细胞雄性新西兰大耳白兔20只，清洁级，体质量(2.00±0.02) kg[北京市房山区官道顺利养殖场提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0004]，以标准动物饲料饲养，饲养室内环境温度保持在18～29 ℃。HPAECs购自美国ScienCell公司。

1.2仪器及试剂低氧高二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；DMEM/F12培养液(美国M&G公司)，NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1及PGI2放射免疫测定试剂盒(北京华英生物技术研究所)。

1.3药物益肺活血复方(黄芪100 g、潞党参120 g、白术60 g、当归90 g、桃仁120 g、红花90 g、牛膝80 g、川芎50 g、赤芍60 g、陈皮70 g、柴胡50 g、桔梗50 g、枳壳60 g、甘草30 g、生地黄90 g)加重蒸水1 500 mL，同时煎沸20 min,过滤2次后合并2次滤液，4 000 r/min离心15 min后取上清液，浓缩至含生药0.001 g/L。

1.4含药血清的制备20只新西兰大耳白兔采用随机数字表法分为4组：空白对照组及低、中、高剂量益肺活血复方组，每组5只。每天2次分别以中药低剂量(10 g/kg)、中剂量(20 g/kg)、高剂量(40 g/kg)灌胃，空白对照组以等体积的生理盐水灌胃，连续7 d。末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)给药2 h后腹主动脉采血，离心后分离血清，合并同组含药血清，0.22 μm微孔滤膜过滤后，-80 ℃保存备用。

1.5细胞培养、分组及干预HPAECs于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养，细胞贴壁生长，呈多角形、铺路石样外观；待细胞生长至80%融合后用胰蛋白酶消化传代1次，方法参照美国ScienCell公司产品说明书。选用3～5代的细胞用于实验。将HPAECs细胞悬液接种到含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养至细胞70%融合后，分组并干预。空白对照组：体积分数21% O2、体积分数5% CO2条件下加入含体积分数10%空白对照组血清的DMEM/F12培养液；模型组：体积分数5% O2、体积分数8% CO2条件下加入含体积分数10%空白对照组血清的DMEM/F12培养液；低、中、高剂量益肺活血复方组：体积分数5% O2、体积分数8% CO2条件下加入含体积分数10%低、中、高剂量益肺活血复方组含药血清的DMEM/F12培养液。各组细胞分别培养12 h后收集细胞培养液上清或细胞用于检测。

1.6细胞微结构的透射电镜观察共同孵育12 h后，各组细胞经PBS液漂洗3次后，用体积分数2.5%的戊二醛4 ℃固定1 h，然后用10 g/L锇酸4 ℃固定120 min，再进行梯度乙醇脱水、环氧丙烷置换及包埋，最后进行连续超薄切片及电镜观察。

1.7细胞培养液上清ET-1及PGI2含量的测定共同孵育12 h后，收集各组细胞培养液上清，置于-20 ℃冰箱储存备测。ET-1和PGI2测定均采用放射免疫法，严格按试剂盒说明进行操作。ET-1检测灵敏度<0.005 pg/L，批内变异<10%，批间变异<15%。PGI2检测灵敏度<0.025 pg/L，批内变异<3.5%,批间变异<10%。实验重复6次。

1.8细胞培养液中NO含量的硝酸还原酶法测定

将生长良好的HPAECs接种于12孔培养板，待细胞生长至70%融合时，按1.5分组加不同的含药血清干预，12 h后取细胞培养液100 μL，按照NO测定试剂盒说明进行操作。用721型分光光度计测定550 nm处的吸光度，并计算NO含量。实验重复6次。

1.9统计学处理应用SPSS 13.0处理数据，采用单因素方差分析比较5组细胞培养液或培养液上清中ET-1、NO及PGI2含量的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1细胞微结构的透射电镜观察与空白对照组相比，透射电镜下模型组可见细胞损伤，细胞膜不完整，胞质溶解，出现裸核，核周间隙扩张，核膜内外层之间分开；线粒体及内质网扩张，膜不完整。与模型组相比，低剂量益肺活血复方组细胞同样呈现较重的细胞损伤，而中、高剂量益肺活血复方组细胞损伤较模型组明显减轻。见图1。

图1 透射电镜下各组HPAECs微结构的改变

2.2益肺活血复方含药血清对HPAECs分泌ET-1、NO及PGI2的影响各组细胞处理12 h后，模型组ET-1含量高于空白对照组；而与模型组相比，中、高剂量益肺活血复方组ET-1含量减少。模型组NO和PGI2含量低于空白对照组；而与模型组相比，中、高剂量益肺活血复方组NO及PGI2含量增高。见表1。

表1 各组HPAECs细胞培养液或培养液上清中ET-1、NO及PGI2含量比较(n=6)

*:与空白对照组比较，P<0.01；#:与模型组比较，P<0.01。

3 讨论

研究[5]表明，肺血管内皮细胞损伤在低氧性肺动脉高压的发生发展中起着重要的作用。肺血管内皮细胞不仅具有屏障功能，而且是许多血管活性物质合成、代谢的主要场所。低氧使血管内皮细胞水肿，甚至凋亡，导致细胞屏障功能受损；另一方面还导致内源性肺血管舒张和收缩物质分泌失衡。益肺活血复方是治疗慢性肺心病的经验方[3-4]。

低氧条件下内皮细胞水肿，失去正常排列，细胞质中出现颗粒，粗面内质网扩张，线粒体肿胀且嵴较模糊，胞质内出现巨大空泡；内皮细胞结构受损大大降低了细胞屏障功能。ET-1主要由内皮细胞分泌，在维持机体血管紧张性方面发挥重要作用，能引起强烈的血管收缩，促进平滑肌细胞、成纤维细胞的增殖，最终导致血管重塑和肺动脉高压的形成。研究[6]发现，低氧能引起培养的血管内皮细胞ET-1基因转录和肽合成的增加。内皮细胞分泌的内皮源性舒张因子主要为NO和花生四烯酸代谢产物PGI2。肺血管内皮细胞产生的NO可迅速扩散进入血管平滑肌细胞，进而松弛平滑肌[7]。NO还可以直接抑制血管平滑肌细胞增生，抑制血管重塑[8-9]。王慧等[10]研究发现，低氧可导致大鼠肺血管内皮功能障碍，NO生成减少；而PGI2由表达于内皮细胞内质网和平滑肌细胞核膜及质膜上的前列环素合酶参与合成，具有较强的血管舒张和抗有丝分裂活性，现已广泛运用于临床治疗肺动脉高压。

该研究发现，低氧高二氧化碳造成HPAECs的细胞微结构受损，且低氧下HPAECs分泌的ET-1明显高于常氧组，NO和PGI2明显低于常氧组。而中、高剂量的益肺活血复方含药血清能减轻细胞结构的损伤程度，减少HPAECs分泌ET-1，促进其分泌NO和PGI2。因此，作者推断益肺活血复方可能通过减轻HPAECs结构损伤的程度从而改善其内分泌功能；或者益肺活血复方可直接影响内皮细胞血管活性物质生成的某个环节，并在肺动脉高压的治疗中发挥一定的作用。但其调控内皮细胞分泌功能的具体机制还需进一步研究。

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