方 立，王雪晶，荆 婧，马耀华，邓文静，张雯雯，滕军放

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

自噬是将退变细胞器及长寿命蛋白隔离并运送到溶酶体代谢，以应对各种有害刺激[1-2]。自噬有微自噬、分子伴侣自噬和巨自噬3种形式，通过与溶酶体结合消化大分子物质为其主要特点[3]。证据[4]表明，巨自噬的激活可能在缺血脑组织中起保护作用。重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)是一种造血生长因子，具有促进中性粒细胞系造血祖细胞增殖分化的能力，近来研究显示其在神经组织的修复中发挥着重要作用。rhG-CSF能显著减少脑缺血梗死体积，改善早期神经功能[5]。然而rhG-CSF对脑缺血神经细胞保护的具体机制尚不清楚，其对巨自噬的影响也鲜见报道。自噬微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)是巨自噬的标志蛋白。LC3有胞质型(LC3Ⅰ)和膜型(LC3Ⅱ)2种类型。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可反映巨自噬水平的高低。作者观察了缺血对神经元细胞和脑缺血大鼠脑组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的影响，探讨rhG-CSF对巨自噬的调控及其可能的神经保护机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料成年雄性SD大鼠，体质量(250±30) g，购自河南省实验动物中心；大鼠神经元SH-SY5Y细胞为中南大学湘雅医院唐北沙教授馈赠；rhG-CSF购自山东泉港药业有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)和MTT购自美国Sigma公司；LC3一抗购自MBL公司，二抗购自美国Santa Cruz公司；免疫组化二步法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，GAPDH抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2细胞缺氧模型制备与处理SH-SY5Y细胞用DMEM(含体积分数10%胎牛血清)培养液，置于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度培养箱培养。取对数生长期细胞，用氧糖剥夺法制作细胞缺氧模型。将培养基换为预先以无氧混合气体(体积分数95%N2+体积分数5%CO2)填充30 min的无糖DMEM培养液；然后将细胞立即置于无氧混合气体填充的密闭容器中，37 ℃、饱和湿度条件下培养4 h。随后分别加入0、100、200 μg/L的rhG-CSF，继续原环境培养48 h。

1.2.1 Western blot检测细胞LC3蛋白的表达 rhG-CSF处理48 h后，抽提细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，取50 μg样品经SDS-PAGE电泳，后经转膜、脱脂奶粉封闭，加入抗LC3抗体(稀释300倍)4 ℃过夜，次日加入过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(稀释5 000倍)水平脱色摇床上孵育2 h，用ECL试剂盒使膜上的免疫活性蛋白显色，暗室中行X线胶片曝光，胶片上蛋白条带经扫描后用Quantity one进行灰度分析，以GAPDH作为内参照。实验重复3次。

1.2.2 MDC荧光染色检测细胞巨自噬空泡 各组细胞rhG-CSF处理48 h后，弃去培养液，多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，用终浓度为0.05 mmol/L的MDC于37 ℃避光温育60 min后，吸弃染液，PBS洗涤，荧光显微镜下(×400)观察，各组细胞随机抽取10个不相重复的视野观察拍照。流式细胞仪分析。

1.2.3 MTT比色法检测细胞活力 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，调整细胞密度为1×107L-1接种于96孔培养板，过夜贴壁后制备体外缺氧模型，4 h后加入不同浓度的rhG-CSF(0、100、200 μg/L)，每组设8个复孔，体积分数5%CO2培养箱、37 ℃条件下继续培养48 h。于结束前4 h，每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL；4 h后弃上清培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min左右；结晶物充分溶解后置酶标仪于490 nm波长测吸光度(A)值。细胞活力=实验孔A值/对照孔A值。

1.3大鼠局灶性脑缺血模型的建立与处理采用改良的Zealonga线栓法建立局灶性脑缺血模型。60只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、rhG-CSF组，每组20只。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，取颈部正中切口，分离右侧颈总动脉，于近心端距分叉处4 mm切口插入栓线,沿颈内动脉上行,插入长度(19.0±0.5) mm，至大脑中动脉起始部，结扎栓线，以制成局灶性脑缺血模型。假手术组手术过程同上，但不插入线栓。缺血4 h后，假手术组不予药物处理；模型组腹部皮下注射生理盐水50 μg/(kg·d)，连续5 d；rhG-CSF组腹部皮下注射rhG-CSF 50 μg/(kg·d)，连续5 d。所有受试动物于注药7 d后，断头快速取脑，自相同断面(前囟门)将损伤侧大脑冠状切开。一部分用甲醛固定，石蜡包埋切片；另一部分置液氮中冻存备用。

1.3.1 Western blot检测缺血额叶皮层神经元LC3蛋白的表达 取出液氮中脑组织移入玻璃匀浆管中，加入9倍体积的预冷生理盐水，冰上充分研碎匀浆。3 500 r/min离心10 min，移弃上清液，按BCA法测蛋白浓度后取50 μg样品，其余处理同1.2.1。

1.3.2 免疫组化检测缺血额叶皮层神经元LC3蛋白的表达 石蜡切片常规脱蜡，用柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L，pH 6.0)热抗诱导修复(微波3档20 min)，室温下冷却，PBS洗3次，并用H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min，PBS洗3次，滴加LC3兔抗人多克隆抗体(稀释200倍)，4 ℃孵育过夜，PBS再次冲洗，二抗孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木素衬染，树脂封片，显微镜下随机选取10个不同视野的细胞观察，以细胞中出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞。根据阳性细胞的比率评分：≤50%为 3 分，～65%为 4 分，～75%为5分，>75%为6分。

1.3.3 改良的神经功能缺损评分 由不了解实验分组的人员对动物进行运动(肌肉状态、异常动作)、感觉(视觉、触觉、本体感觉)和反射检查，综合评价神经系统损伤的严重程度。评分最高分为18分，正常为0分，分值越高，说明神经损害越严重。各组大鼠药物干预前进行评分，并于注药7 d后再次评分。

1.4统计学处理采用SPSS 16.0处理数据。各组SH-SY5Y细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、巨自噬空泡数和细胞活力的比较，以及各组大鼠缺血额叶神经元LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3Ⅱ蛋白表达的比较行单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。各组大鼠不同时间点神经功能缺损评分的比较行重复测量数据的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1rhG-CSF对缺氧SH-SY5Y细胞巨自噬的影响

2.1.1 各组细胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比较 见图1、表1。

图1 各组细胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比较

2.1.2 各组细胞巨自噬空泡数比较 见图2、表1。

2.1.3 各组细胞活力的比较 见表1。

2.2动物实验结果

2.2.1 各组大鼠缺血额叶皮层神经元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比较 见图3、表2。

图2 各组细胞巨自噬空泡数比较(×400)

表1 各组细胞巨自噬及细胞活力比较

*:与0 μg/L rhG-CSF组比较，P<0.05；#:与100 μg/L rhG-CSF组比较，P<0.05。

图3 各组大鼠缺血额叶皮层神经元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ检测结果

2.2.2 各组大鼠缺血额叶皮层神经元LC3蛋白的表达 见图4、表2。

图4 各组大鼠缺血额叶皮层神经元LC3蛋白的表达(SP,×400)

表2 各组大鼠缺血额叶神经元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ及LC3 Ⅱ蛋白表达(n=20)

*：与假手术组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。

2.2.3各组大鼠神经功能缺损评分见表3。

表3 各组大鼠神经功能缺损评分比较(n=20)

F组间=20.403,F时间=19.193,F交互=33.415,P均<0.001。

3 讨论

研究[6]表明，巨自噬作为一种应激反应，参与了脑缺血的病理生理过程。研究[7]表明rhG-CSF参与了中枢神经系统修复过程。rhG-CSF可减少缺血病灶大小，抑制水肿形成，有抗炎和抗凋亡作用，可以改善中风结局[8]。rhG-CSF还能动员干细胞向病损部位迁移,修复坏死组织[9]。该研究发现，体外细胞缺氧模型rhG-CSF给药组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、巨自噬空泡数及细胞活力均高于未加药组，且随给药浓度增加，自噬活性及细胞活力均逐渐增强。大鼠脑缺血模型rhG-CSF干预后第7天，模型组缺血额叶皮层神经元的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3表达水平均高于假手术组，提示局灶性脑缺血后神经元巨自噬水平升高，缺血脑组织可能通过增强自噬促进自我修复；而rhG-CSF组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3表达水平又较模型组增高，表明rhG-CSF干预可上调局灶性脑缺血后神经元的巨自噬水平。rhG-CSF组较模型组大鼠神经功能缺损评分降低，说明神经功能恢复明显，提示rhG-CSF有修复神经的作用。

研究[10]发现当巨自噬清除线粒体后神经细胞死亡也并非不可避免。Lockshina等[11]认为细胞轻度受损后，自身首先通过激活自噬途径以清除有害蛋白。缺血再灌注时活性氧(ROS)是自噬的主要诱导因素。活性氧诱导线粒体损伤、功能紊乱，线粒体通透性转换孔开放和形成线粒体碎片，这反过来又促进自噬及自噬清除线粒体。活性氧氧化并抑制半胱氨酸蛋白酶Atg4的活化，导致LC3的脂化和自噬体形成[12]。自噬体吞噬消除受损的线粒体，减少活性氧生产，抑制促凋亡因子如细胞色素C的释放，从而抑制细胞凋亡[13]。研究[14]发现短暂脑缺血后，脑组织的自噬标记物表达上调，同时神经细胞增加，显示自噬激活是一个潜在的脑损伤早期保护机制。Yan等[15]也发现通过药物预处理调节自噬激活可能减轻缺血细胞损伤。该研究发现rhG-CSF干预下局灶性脑缺血大鼠神经细胞自噬水平升高，大鼠神经功能恢复，且神经元细胞活力增加，提示rhG-CSF能够上调脑缺血后巨自噬活动，并促进神经功能的修复。

总之，缺血缺氧损伤后，rhG-CSF可能通过调控巨自噬水平起到保护神经元的作用。

[1]He C, Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy[J]. Annu Rev Genet,2009,43:67

[2]夏立平，李凌云，费喜峰，等.自噬参与6-羟基多巴胺诱导多巴胺神经元死亡的实验观察[J]. 南方医科大学学报，2010，30(12)：2649

[3]韩笑，李丹，林成仁，等.自噬研究新进展[J]. 解放军医学杂志，2010，35(10)：1267

[4]Gabryel B, Kost A, Kasprowska D，et al.Neuronal autophagy in cerebral ischemia--a potential target for neuroprotective strategies? [J].Pharmacol Rep, 2012,64(1):1

[5]Solaroglua I, Tsubokawa T, Cahill J,et al.Anti-apoptotic effect of granulocyte-colony stimulating factor after focal cerebral ischemia in the rat[J]. Neuroscience, 2006, 143(4):965

[6]Wang P,Guan YF,Du H,et al.Induction of autophagy contributes to the neuroprotection of nicotinamide phosphoribosyltransferase in cerebral ischemia[J]. Autophagy,2012,8(1):77

[7]Schneider A, Kruger C, Steigleder T, et al.The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis[J]. J Clin Invest, 2005,115(8):2083

[8]Gibson CL, Bath PM,Murphy SP. G-CSF reduces infarct volume and improves functional outcome after transient focal cerebral ischemia in mice[J]. J Cereb Blood Flow Metab,2005,25(4):431

[9]王莉，徐浩文.rhG-CSF对缺氧脑瘫大鼠内源性神经干细胞增殖、迁移及分化的影响[J].郑州大学学报:医学版，2010,45(5):775

[10]Villunger A.When cells die Ⅱ: a comprehensive evaluation of apoptosis and programmed cell death[J]. Cell Death Differ, 2004,11(7):790

[11]Lockshina RA,Zakerib Z.Apoptosis, autophagy, and more[J]. Int J Biochemi Cell Biol,2004,36(12):2405

[12]Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E,et al.Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4[J].EMBO J,2007,26(7):1749

[13]杨聚荣，洪权，蔡广研，等.miR-34a调控HEK293细胞自噬作用的初步研究[J]. 解放军医学杂志，2010，35(2)：166

[14]Balduini W, Carloni S,Buonocore G.Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury[J]. J Matern Fetal Neonatal Med,2012,25(Suppl 1):30

[15]Yan L, Vatner DE, Kim SJ,et al.Autophagy in chronically ischemic myocardium[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(39):13807