骆梅青，卜 庆，曹轶林，郑桂银，伍爱华

桂林医学院附属医院肿瘤内科 桂林 541001

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居全球首位。目前最新理论[1]认为肿瘤是一种干细胞疾病，恶性肿瘤中存有数量极少的肿瘤干细胞，在肿瘤的形成和生长中起着决定性作用，这些肿瘤干细胞具有无限增殖、自我更新及分化的能力，并表达相似的分子标记和基因产物。 Nanog在2003年由Chambers等[2]报道,为肿瘤干细胞标记物，在维持细胞自我更新和保持全能性中发挥重要作用，可促进肿瘤的增生、侵袭和转移，目前在乳癌、肝癌、前列腺癌及结肠癌等恶性肿瘤中都有报道[3-4]。作者通过免疫组化方法和实时荧光定量PCR方法检测了NSCLC组织中Nanog的表达，并进一步探讨Nanog的表达与NSCLC患者临床病理因素及预后的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象桂林医学院附属医院2005年1月至2007年3月手术切除或经颈胸腔镜活检的NSCLC标本106例，男81例，女25例。患者年龄35～75岁,中位年龄50岁。106例中鳞状细胞癌(简称鳞癌)57例,腺癌49例，均经病理明确诊断。病理分级：Ⅰ级39例，Ⅱ级34例，Ⅲ级33例。T分期：T1～261例，T3～445例；N分期：N059例，N1～347例。另取10例正常肺组织标本(为明确诊断而行CT下肺穿刺或纤支镜检查，病理诊断为正常肺组织)作对照。标本一部分液氮保存，另一部分石蜡包埋切片。所有患者术前均未做化疗、放疗, 有完整的临床和随访资料；随访至2012年9月，生存期为确诊之日至死亡或末次随访时间。

1.2主要试剂鼠抗人Nanog单克隆抗体购自美国Cell Signal公司,SP法免疫组化试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发公司。Trizol购自Invitrogen公司,逆转录试剂盒为美国Ferments公司产品,SYBR Green PCR为 TaKaRa公司产品，实时荧光定量PCR仪为美国安捷伦公司产品。其他常规分子生物学试剂均购自Sigma公司。

1.3NSCLC和正常肺组织中Nanog蛋白的检测

实验步骤严格按照免疫组化SP试剂盒说明进行。石蜡切片常规脱蜡至水后，体积分数3%过氧化氢溶液室温下孵育15 min，高压抗原修复2 min后冷却至室温，滴加山羊血清,室温下孵育10 min,弃血清,滴加一抗工作液(按1100稀释),4 ℃冰箱过夜，滴加生物素标记的二抗,37 ℃孵育10 min，DAB显色，自来水反复冲洗，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水,二甲苯透明，中性树胶封片。用 PBST代替一抗作阴性对照。SP染色阳性反应物呈棕黄色。采用半定量积分法判定结果, 每张切片选5个高倍视野,计数100个细胞,阳性细胞百分比≤5%为0分,～25%为1分,～50%为2分,～75%为3分,>75%为4分;根据免疫阳性细胞染色程度,黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。两项积分相乘,0～1分为阴性，≥2分为阳性[5]。

1.4NSCLC和正常肺组织中NanogmRNA的测定取10～15 mg液氮保存的组织标本，Trizol提取RNA，逆转录合成cDNA。PCR反应体系为20 μL，Nanog上游引物：5’-CAGAAGGCCTCAGCACCTAC-3’,下游引物：5’-ATTGTTCCAGGTCTGGTTGC-3’，扩增产物大小为111 bp。内参β-actin上游引物：5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，下游引物5’-CCA GAGGCGTACAGGGATAG-3’，扩增产物大小为152 bp。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45个循环。实时荧光定量PCR仪自动生成Ct并绘制标准曲线及融解曲线。所生成的Ct值取均值后代入标准曲线，得出目的基因的表达量。

1.5统计学处理采用SPSS 13.0处理数据。采用确切概率法比较NSCLC和正常肺组织中Nanog蛋白阳性表达率的差异,χ2检验比较不同人口学特征和临床病理特征的NSCLC患者Nanog蛋白阳性表达率的差异。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验进行生存分析。采用单因素方差分析比较NSCLC和正常肺组织及不同病理级别的NSCLC组织中Nanog mRNA表达量的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同组织中Nanog蛋白的表达Nanog蛋白阳性染色为棕黄色颗粒, 主要分布于NSCLC细胞胞核中，见图1。NSCLC组织中Nanog蛋白阳性表达率为24.5%(26/106)，而在正常组织中未见表达，2者相比，差异有统计学意义(P=0.114)。

图1 正常肺组织(A)、肺鳞癌组织(B)和肺腺癌组织(C)中Nanog蛋白的表达(SP，×400)

2.2Nanog蛋白的表达与NSCLC患者一般人口学特征及临床病理特征的关系结果见表1。

2.3Nanog蛋白的表达与NSCLC预后的关系生存曲线见图2、3。肺鳞癌患者中Nanog蛋白阴性表达者及阳性表达者的M(T25，T75) 分别为36(20，60)和32(16，36)个月，Nanog蛋白的表达与肺鳞癌患者的预后无关(χ2=0.013，P=0.917)，但肺腺癌患者中Nanog蛋白阴性表达者及阳性表达者的M(T25，T75) 分别为48(36，56)和33(14，57)个月，Nanog阴性表达者预后较好(χ2=5.352，P=0.020)。

表1 Nanog蛋白的表达与NSCLC患者一般人口学特征及临床病理特征的关系

图2 Nanog蛋白的表达与肺鳞癌患者预后的关系

图3 Nanog蛋白的表达与肺腺癌患者预后的关系

2.4不同组织中NanogmRNA的表达Nanog mRNA在正常肺组织中的表达量(0.277±0.190)明显低于NSCLC组织(0.950±0.183)，2者相比，差异有统计学意义(F=122.662，P<0.001)；Nanog mRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级NSCLC组织中的表达量分别为(0.831±0.194)、(0.905±0.144)和(1.076±0.123)，3者相比，差异有统计学意义(F=4.047,P=0.020)。

3 讨论

目前肿瘤干细胞理论认为，肿瘤细胞由数量较少的肿瘤干细胞和大多数表型不同的肿瘤分化细胞组成[6]。肿瘤干细胞数量较少但难以清除的特点是导致肿瘤治疗效果差、生存期短的主要原因[7]。Nanog基因是胚胎发育早期的转录因子之一，在胚胎发育过程中维持正常的组织分化和个体发育；Nanog基因也是体外诱导iPS的主要基因之一，为肿瘤干细胞标记物。基于这种观点，检测调控肿瘤干细胞自我更新的关键基因Nanog的表达在肿瘤研究中具有重要意义[8]。目前研究[9]表明，Nanog除了能在生殖细胞系及生殖细胞来源的恶性肿瘤细胞中表达外，在肺癌组织中也有表达。

该研究结果表明，Nanog蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率高于正常肺组织，提示Nanog蛋白的表达可能与NSCLC的发生有关。此外，Nanog蛋白的表达与肿瘤的组织学类型有关，在腺癌中的表达明显高于鳞癌，与文献[10]的研究结果一致。同时，该研究结果还显示，Nanog蛋白的阳性表达率随着病理级别的增高有升高的趋势，提示Nanog蛋白的表达可能与NSCLC的恶性程度有关。另有文献[11]报道，在肾细胞癌中Nanog为抑癌因素，提示在不同类型肿瘤的发生发展过程中，即使是同一种基因也会发挥不同的作用。

该研究结果还显示，与正常肺组织相比，Nanog mRNA在NSCLC组织中高表达，并且随病理级别的增高有升高的趋势。有些学者[12]认为其原因可能为导致间充质细胞转化的发生，但阐明其具体机制还需相关实验进一步验证。体外实验[13-14]表明，干细胞标记物会随着干细胞分化程度的增高而减少，这与文献[15]报道的肿瘤干细胞标记物与肺癌组织的不同分化程度有关相一致。

此外，该研究结果还显示，Nanog蛋白的表达与肺鳞癌的预后无关，但与肺腺癌的预后有关，Nanog蛋白阴性表达者预后较好。曾有报道[16]发现干细胞相关因子主要在肺腺癌中表达，但从 Nanog角度国内外尚未有相关报道。

综上所述，Nanog蛋白和mRNA在NSCLC组织中高表达，可能与NSCLC的发生发展有关；Nanog蛋白的表达与肺腺癌的预后有关。该研究结果可能为分析NSCLC的生物学行为、进一步开展新的基因治疗提供帮助。

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