王 冲, 王伟琼，余 建，刘延方，孙 玲，孙 慧，黄 河#

1)郑州大学第一附属医院血液科 郑州 450052 2)浙江大学附属第一医院骨髓移植中心 杭州 310003

Tara蛋白作为一个新的F-肌动蛋白结合蛋白，由Seipel等[1]在2001年首先鉴定出来。Tara蛋白含有一个氨基端的PH结构域和一个羧基端的卷曲螺旋结构域，在酵母及脊椎动物中均有广泛的表达。有研究[2]表明Tara蛋白不但在调控肌动蛋白及细胞骨架蛋白的组合过程中起重要作用，在F-肌动蛋白的形成中也起关键作用。作者在前期研究[3]中发现Tara蛋白能够与E3泛素化连接酶HECTD3结合进而发生泛素化降解，并且HECTD3能够通过调控Tara蛋白的表达量参与细胞周期的调节，但Tara蛋白参与细胞胞质分裂的具体机制并不清楚。为此，作者进行了如下研究，探讨Plk1磷酸化修饰Tara蛋白对HeLa细胞胞质分裂及增殖的影响。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂人胚肾293T细胞株及人宫颈癌HeLa细胞株由浙江大学血液分子生物学实验室保存，胎牛血清购自Hyclone公司，青、链霉素和DMEM培养基购自Invitrogen公司，胰蛋白酶购自华美(SABC)公司，Nocodazole、G418购自Sigma公司。

1.2质粒含有Flag标记的Tara真核表达质粒通过PCR从人睾丸cDNA文库中扩增获得；BD-Tara、GFP-Tara、Flag-Tara、GST-Tara质粒均通过PCR扩增Tara片段，于EcoRⅠ或SalⅠ限制性内切酶位点分别插入pGBKT7、pEGFP-C2、p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3质粒构建而成；Flag-Plk1、GST-Plk1质粒通过PCR扩增Plk1片段插入p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3质粒构建而成。所有质粒均经测序证实。

1.3抗体鼠抗GFP单克隆抗体购自Cell Signaling公司，鼠抗Flag单克隆抗体M2、鼠抗α-tubulin单克隆抗体购自Sigma-Aldrich公司，兔抗Tara多克隆抗体由课题组自行免疫兔并纯化获得，鼠抗Plk1单克隆抗体、鼠抗磷酸化丝氨酸单克隆抗体购自Abcam公司，罗丹明偶联羊抗鼠IgG抗体购自Jackson Immunoresearch公司。

1.4其他材料AH109酵母菌种及BL21大肠杆菌菌种由浙江大学血液分子生物学实验室保存，人睾丸cDNA文库、MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3试剂盒购自Clontech公司，限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4 DNA连接酶、pyrobest酶及相关缓冲液购自TaKaRa公司，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.5Plk1与Tara的酵母双杂交实验实验步骤按照Clontech公司酵母双杂交操作手册及文献[4]进行，共获得18个阳性克隆，提取质粒进行PCR反应,产物经测序鉴定，并与GenBank进行同源性比较。

1.6重组Tara载体转染、免疫共沉淀实验及免疫印迹检测转染和免疫共沉淀实验及免疫印迹检测步骤参照有关说明书及文献[4]进行操作。

1.7GST融合蛋白纯化、体外沉降实验和Tara蛋白体内外磷酸化实验GST融合蛋白及GST-Tara融合蛋白体外表达及纯化参照Qiagen公司重组GST蛋白纯化树脂说明书操作。纯化获取的重组蛋白质4 ℃保存；体外沉降实验操作步骤详见文献[4]。体外表达并纯化GST及GST-Tara融合蛋白后进行体内外磷酸化实验，步骤详见文献[4]。

1.8Plk1磷酸化Tara对胞质分裂及细胞增殖的影响以相应真核表达质粒转染细胞24 h后，取出盖玻片，并以相应抗体进行免疫荧光实验检测磷酸化Tara对胞质分裂的影响，免疫荧光实验步骤详见文献[4]。分别收集转染质粒及其对照的HeLa细胞，经PBS洗涤后，4 ℃条件下用体积分数70%冰乙醇固定30 min，离心。细胞重悬于PBS中，加入含有1 mg/L RNA酶的碘化丙啶至20 mg/L，4 ℃避光染色1 h，流式细胞仪检测细胞增殖情况。

2 结果

2.1Plk1与Tara蛋白酵母双杂交和免疫共沉淀结果共转pGADT7-Plk1与pGBKT7-Tara的AH109菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal培养板能够生长并激活报告基因。在HeLa细胞中，内源性Plk1能够与Tara抗体发生共沉淀反应，形成复合物，而与对照血清无结合(图1)。

图1 Plk1与Tara的免疫共沉淀结果

2.2Plk1与Tara体外沉降和Plk1体内外磷酸化Tara的实验结果GST-Plk1能够与His-Tara相结合，形成复合物，而空GST蛋白则不能将His-Tara沉淀下来(图2)。将Plk1与Tara进行体外磷酸化反应，质谱结果显示T457是Plk1的磷酸化位点。采用PCR定点突变方法将457位点突变为丙氨酸，体外表达His-Tara T457A及His-Tara WT融合蛋白，再次进行体外磷酸化反应，结果显示Plk1能够在体外磷酸化His-Tara WT及对照蛋白，而不能磷酸化His-Tara T457A蛋白 (图3左)。以100 nmol/L Nocodazole处理HeLa细胞18 h，收集细胞前，再分别加入1 μmol/L DMSO或者Plk1特异性小分子抑制剂GW843682X处理8 h，收集细胞进行免疫共沉淀实验。结果显示加入GW843682X处理后，Tara的磷酸化条带明显减弱(图3右)。

2.3Plk1磷酸化Tara对细胞胞质分离的影响免疫荧光结果显示：过量表达Tara非磷酸化突变体会导致明显的染色体排列异常(图4)。

2.4Plk1磷酸化Tara对HeLa细胞增殖的影响流式细胞术检测结果显示，转染GFP-Tara T457A的HeLa细胞4倍染色体发生率为(51.60±3.71)%，转染GFP空载体、GFP-Tara野生型及GFP-Tara T457E的HeLa细胞4倍染色体发生率分别为(5.69±2.36)%、(6.54±2.69)%和(6.91±3.18)%，4组相比差异有统计学意义(F=74 329.277，P<0.001)。

图2 Plk1与Tara的体外沉降结果

图3 Plk1体内外磷酸化修饰Tara结果

图4 Plk1磷酸化Tara对细胞胞质分离的影响

3 讨论

染色体的不稳定性同肿瘤的发生发展密切相关，被认为是肿瘤发生的重要机制[5]。而肿瘤细胞正常的胞质分裂是一个极其精细复杂的多因素、多环节的调控过程。Plk1作为一个在细胞胞质分裂过程中起关键作用的磷酸化激酶，在细胞胞质分裂的各个亚环节中均起到了关键调控作用[6]。作者此前的研究[7-8]已经证实多种端粒相关蛋白均能够被Plk1磷酸化修饰进而参与有丝分裂进程的调控，但Plk1调节细胞周期的具体机制目前仍不清楚。Tara蛋白最初作为一个新的F-肌动蛋白结合蛋白被鉴定出来，此前的研究[1]显示Tara通过调节F-肌动蛋白表达量的变化参与肌动蛋白细胞骨架的形成。而作者之前的研究[3]提示Tara蛋白有可能是同时参与细胞骨架组成及细胞有丝分裂调控的关键信号分子，进一步深入探讨Plk1及Tara的生物学功能，将为认识细胞骨架组成和胞质分裂之间的联系提供新的思路。

在该研究中，作者采用酵母双杂交的方法成功筛选出的Plk1是一个新的Tara结合蛋白。Plk1能够与Tara在体内外相互结合，能够在有丝分裂期磷酸化修饰Tara。免疫荧光结果显示：Tara非磷酸化突变体能够导致Hela细胞出现大量异常排列的染色体，而野生型和模拟磷酸化突变体则没有异常表型出现，说明Plk1对Tara的磷酸化修饰对保证细胞正常的胞质分裂是必须的。同时该研究结果显示：过量表达Tara非磷酸化突变体会导致细胞的增殖明显受阻，表明Plk1可能通过磷酸化Tara参与了对细胞增殖的调控，这为进一步研究Plk1对细胞周期和细胞增殖调控提供了新的线索。

综上所述，该研究证明了Plk1能够磷酸化并调控Tara，Tara的非磷酸化突变体能导致细胞胞质分裂及增殖出现异常。

[1]Seipel K, O’Brien SP, Iannotti E, et al. Tara, a novel F-actin binding protein, associates with the Trio guanine nucleotide exchange factor and regulates actin cytoskeletal organization[J]. J Cell Sci,2001, 114(Pt 2):389

[2]Grisendi S, Bernardi R, Rossi M, et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis[J]. Nature,2005, 437(7055):147

[3]Yu J, Lan J, Zhu Y, et al. The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara[J]. Biochem Biophys Res Commun,2008, 367(4):805

[4]王冲, 余建, 黄河. Plk1 磷酸化修饰 PinX1 对宫颈癌 HeLa 细胞有丝分裂及凋亡的影响[J]. 郑州大学学报:医学版, 2013, 48(3):323

[5]Thompson SL, Bakhoum SF, Compton DA. Mechanisms of chromosomal instability[J]. Curr Biol,2010, 20(6):R285

[6]Petronczki M, Lenart P, Peters JM. Polo on the Rise-from mitotic entry to cytokinesis with Plk1[J]. Dev Cell,2008, 14(5):646

[7]Wu ZQ, Yang X, Weber G, et al. Plk1 phosphorylation of TRF1 is essential for its binding to telomeres[J]. J Biol Chem,2008, 283(37):25503

[8]Wang C, Yu J, Yuan K, et al. Plk1-mediated mitotic phosphorylation of PinX1 regulates its stability[J]. Eur J Cell Biol,2010, 89(10):748