张春艳，王遂泉，吴辛刚，欧阳杰，林福全，洪为松，许爱娥

（浙江中医药大学附属杭州市第三人民医院，杭州310009）

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤黏膜疾病，人群中的发病率为1%～2%，临床上易于诊断而难于治疗，严重影响美观，给患者带来极大的困扰，进而影响了患者的生活质量。随着研究的深入，发现氧化应激在影响白癜风黑素细胞生存及黑素代谢过程中占有重要的作用，是其发病机制之一，患者表皮内的过氧化氢（H2O2）的累积，导致黑素细胞形态和功能改变，进而导致白斑的出现[1-3]。针对此发病学说，一些抗氧化剂被用于白癜风的治疗,其通过减弱H2O2诱导的氧化应激，阻断H2O2对黑素细胞的破坏作用，从而取得较好疗效[4-5]。近来研究发现，许多植物提取物都具有抗氧化作用,在疾病治疗方面疗效好，不良反应小，应用前景广阔[6]。本实验应用氧化应激模型研究9种植物提取物对黑素细胞的抗氧化保护作用，以筛选用于治疗白癜风的药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及来源 B10BR细胞（鼠的永生化黑素细胞）：美国耶鲁大学皮肤科实验室惠赠。

1.1.2 药物1 mol/L H2O2（纯度99%，-20℃分装避光冷藏） 购于美国Sigma公司，临用时室温下融解后，用缓冲液调至终浓度；槲皮素：购于美国Sigma公司，用1 mol/L氢氧化钠配成200 mmol/L的原液；白藜芦醇：购于美国Sigma公司，用DMSO分别配制成200 mmol/L的原液；银杏叶提取物：购于美国Sigma公司，用DMSO分别配制成30 mmol/L的原液。人参皂苷：购于中国标准药品研究院公司，用配成10 mmol/L的原液；茶多酚：购于中国标准药品研究院，用水配成40 g/mL的原液；山茶花提取物、蒺藜提取物、天麻提取物：购于中国标准药品研究院，用DMSO配成100 g/L的原液；枸杞提取物购于中国标准药品研究院公司，用水配成100 g/L的原液。各药液均4℃保存，临用时用新鲜培养液配制终浓度。

1.1.3 试剂 F12液，双抗，胎牛血清（FBS），0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Gibco公司），噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），DAFC抗体（美国Sigma公司），左旋多巴（L-DOPA，美国 Sigma公司），Triton X-100（美国Genview公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 鼠永生化黑素细胞B10BR细胞用含10%FBS、igma 1%双抗的F12培养液，37℃、5%CO2培养箱中常规培养。待细胞生长至融合状态，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，传代。

1.2.2 MTT法测黑素细胞活性 调整细胞为1×104个/孔，接种于96孔板，每孔150 μL。培养24 h后每孔加入药液100 μL，每个浓度设4个复孔；空白对照组仅加入培养液继续培养24 h。24 h后每孔加250 μmol/L H2O2100 μL，加 H2O2孵育 24 h，分别在显微镜下观察细胞变化并拍照保存。然后同上加MTT用酶标仪测定吸光度值（A490值）。

1.2.3 流式细胞仪测细胞内活性氧（ROS）水平 调整细胞为1×105个/孔，接种于12孔板，每孔1 mL。同上依次加药液和H2O2。然后弃原液，胰酶消化，加培养液中和，液体移入EP管4000 r/min离心3 min，弃上清，每管加PBS 800 μL除去空白管，每管加DAFC 抗体 0.2 μL，37℃温育 30 min，流式细胞仪测ROS。

1.2.4 多巴氧化法测酪氨酸酶活性 调整细胞为1×104个/孔，接种于 96 孔板，每孔 150 μL。同上依次加药和H2O2，24 h后PBS洗涤2次，每孔加1%Triton-X100/PBS溶液50 μL，立即放入-80℃冷冻30 min，室温融化裂解细胞2 h，每孔加1%L-DOPA 37℃孵育3～4 h，置酶标仪读值。

1.2.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较用t检验，SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物作用浓度筛选结果 经100,150,200,250,500 μmol/L H2O2处理24 h后，酶标仪下读A值显著降低，黑素细胞活性均下降，其中250 μmol/L H2O2细胞活性下降至对照组的50%～60%。不同浓度的药物处理黑素细胞后检测细胞活性，结果8 g/L枸杞多糖；200 mg/L山茶花提取物；200 mg/L茶多 酚；40 μmol/L 槲皮素；0.3 μmol/L 白藜芦醇；20 μmol/L银杏叶提取物；0.2 g/L蒺藜提取物；0.8 g/L天麻提取物；50 μmol/L人参皂苷的药物处理细胞后，细胞活性不低于对照组，无细胞毒性。选这些浓度用于处理保护细胞（浓度筛选原则是与只加培养液的0浓度组相比，细胞活性无明显降低，且药物浓度相对较高）。见图1。倒置显微镜下观察细胞形态和数量，可见H2O2处理后细胞树突缩短或消失，贴壁细胞数量减少，但以250 μmol/L H2O2最明显；经特定浓度的上述药物预处理细胞后，存活的细胞数目较多，树突无明显回缩。因此初步选取250 μmol/L H2O2及上述浓度的9种植物提取物进行后续抗氧化试验。

2.2 药物预处理对H2O2损伤细胞的保护作用 250μmol H2O2处理细胞 24 h后，MTT 法测得（0.737±0.032）显著低于于空白对照组（t=16.869，P<0.01），黑素细胞活性降低；而经9种植物提取物预处理细胞24 h，其A值升高，均能增强细胞活性（P<0.01），见图2，其中尤以槲皮素（A值 1.290±0.015，t=17.483）、枸杞多糖（1.236±0.005，t=17.938）、蒺藜提取物（1.235±0.004，t=18.003）最显著。

图1 不同药物浓度作用细胞活性的改变

图2 不同药物对H2O2损伤后细胞活性影响

图3 不同药物对细胞内活性氧水平的影响

2.3 药物对细胞内ROS含量的影响 流式细胞仪检测结果显示：单独H2O2组细胞内ROS含量（261.467±3.164，t=25.075）比空白对照组显著升高（P<0.01），而经茶多酚（34.277±0.600，t=60.841）、槲皮素（77.396±1.595，t=53.287）、银杏叶（128.196±4.063，t=40.569）等植物提取物预处理后，ROS含量均不同程度地降低，与H2O2组相比差异有统计学意义（P<0.01）。见图 3。

2.4 H2O2及药物对酪氨酸酶活性影响 经250 μmol/L H2O2处理后，黑素细胞的酪氨酸酶活性（A值0.623±0.008，t=7.056）与空白组相比显著下降（P<0.01），而经8 g/L枸杞提取物、0.2 g/L蒺藜提取物、1 g/L 天麻提取物、200 mg/L 茶多酚、40 μmol/L槲皮素预处理24 h后，黑素细胞的酪氨酸酶活性可明显提高（P<0.01）。其中以枸杞多糖（A值0.774±0.022，t=6.377）、蒺藜提取物（A值 0.831±0.011，t＝15.470）作用最强。见表1。

3 讨论

关于白癜风的发病机制众多繁杂，近年来氧化应激学说成为一个研究焦点。氧化应激损伤导致白癜风的机制主要是局部微环境中活性氧如H2O2可以通过损伤细胞核和线粒体导致黑素细胞的凋亡，同时活性氧也可能影响酪氨酸酶活性导致黑素合成的障碍和减少。过多的活性氧会造成严重的细胞损害，导致凋亡，细胞的凋亡碎片具有很强的免疫原性，可诱发或加重自身免疫反应[7]。Cayio-Andre[8]研究发现H2O2可引起黑素细胞的树状突回缩，H2O2也可引起白癜风色素自体重建表皮的黑素细胞分离和经表皮消失。这表明白癜风患者存在氧化应激失衡，且与H2O2关系密切。同时H2O2增加可引起表皮中酪氨酸酶活性降低，导致黑素合成减少[9]，并对黑素细胞及角质形成细胞具有直接损伤作用[10]。

表1 药物对酪氨酸酶活性的影响 （±s）

表1 药物对酪氨酸酶活性的影响 （±s）

注：** 各组与 H2O2组比较，**P<0.01，n=4。

组别 浓度 A值 P H2O2 250 μmol/L 0.623±0.008空白 0.730±0.013** 0.002枸杞+H2O2 8 g/L 0.774±0.022** 0.003银杏叶+H2O2 2.5 μmol/L 0.609±0.061 0.823山茶花+H2O2 100 mg/L 0.572±0.049 0.354蒺藜+H2O2 0.2 g/L 0.831±0.011** 0.000天麻+H2O2 0.8 g/L 0.746±0.011** 0.001茶多酚+H2O2 200 mg/L 0.645±0.021 0.372槲皮素+H2O2 33.3 μmol/L 0.726±0.018** 0.006白藜芦醇+H2O2 0.3 μmol/L 0.613±0.047 0.839人参皂苷 rg2+H2O2 50 μmol/L 0.674±0.057 0.428

大量的实验研究证实包括此9种药物在内的多种植物提取物具有抗氧化作用[11]。植物提取物治疗白癜风历史悠久，疗效确切，用药安全。之前有学者已揭示槲皮素、白藜芦醇等药物具有显著的对抗H2O2介导的氧化损伤作用[12-13]。樊均明等[14]应用MAC亚溶破模型，探讨了人参皂苷可通过抑制足细胞的细胞内活性氧产生,降低p38蛋白磷酸化水平而抑制细胞凋亡。Jimenez-Cervantes等[15]采用H2O2处理小鼠及人黑素瘤细胞，发现H2O2可以降低黑素合成酶的活性，从而抑制黑素的合成。Nagata等[16]的体外实验结果显示槲皮素可增强人黑素细胞活性和酪氨酸酶活性。

本实验结果发现H2O2处理细胞后，细胞活性、酪氨酸酶活性均显著下降，而ROS含量显著升高；但经特定浓度的9种植物提取物预处理细胞后均能显著抑制H2O2诱导的细胞活性降低，并可以有效降低细胞内ROS含量，其中8 g/L枸杞、0.8 g/L天麻、0.2 g/L蒺藜、40 μmol/L槲皮素又能增强酪氨酸酶活性，与已报道的研究基本一致。

提示这些可能是其治疗白癜风的部分机制。但与既往研究相比，本实验对多种植物提取物的抗氧化活性进行了平行对比，植物提取物达9种，比同类研究种类更多、更为完备，以上研究结果可能为今后寻找筛选具有抗氧化活性治疗白癫风的植物提取物，并检测其对黑素细胞生物学活性的影响提供了依据和参考。

［1］ Schallreuter KU,Moore J,Wood JM,et al.In vivo and in vitro evidence for hydrogen peroxide H2O2accumulation in the epidermis of patients with vitiligo and its successful removal by a UVB-activated pseudocatalase[J].J Investig Dermatol Symp Proc,1999,4:91-96.

［2］ Schallreuter KU,Moore J,Wood JM,et al.Epidermal H2O2accumulation alters tetrahydrobiopterin(6BH4)recylling in vitiligo:Identification of a general mechanism in regulation of all 6BH4-dependent processes[J].J Invest Dermatol,2001,116:167-174.

［3］Agrawal D,Shajil EM,Marfatia YS,et al.Study on the antioxidant status of vitiligo patients of different age groups in Baroda[J].Pigment Cell Res,2004,17:289-294.

［4］Parsad D,Pandhi R,Juneja A.Effectiveness of oral Ginkgo biloba in treating limited slowly spreading vitiligo[J].Clin Exp Dermatol,2003,28:285-287.

［5］Tsiskarishvili N.Cuprum sulfate and vitix in the treatment of vitiligo in children[J].Georgian Med News,2005,121:48-51.

［6］林熙然.药妆品与中药研究 [J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2007,6（4）：257-260.

［7］Glassman SJ.Vitiligo,reactive oxygen species and T-cells[J].Clin Sci(Lond),2011,120:99-120.

［8］Cayio-Andr'e M,Gauthier Y,Pain C,et al.SP-21 Ex vivo vitiligo VS control melanocyte susceptibility to cateeholamines and hydrogen peroxide[J].Pigment Cell Res,2003,16:587-588.

［9］ Jimenez-Cervantes C,Martinez-Esparza M,Perez C,et al.Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress:transient down-regulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor[J].J Cell Sci,2001,114:2335-2344.

［10］Tobin DJ,Swanson NN,Pittelkow MR,et al.Melanocytes are not absent in lesional skin of long duration vitiligo[J].J Pathol,2000,191:407-416.

［11］苗明三.氧自由基、疾病与抗氧化中药[J].河南中医药学刊，2002,17（4）:1-4.

［12］Yun MJ,Yeong GC,Dong SK,et al.Cytoprotective effect of green tea extract and quercetin against hydrogen peroxide-induced oxidative stress[J].Arch Pham Res,2005,28:1251-1256.

［13］Fang JG,Lu M,Chen ZH,et al.Antioxidant effects of resveratrol and its analogues against the free-radical-induced peroxidation of linoleic acid in micelles[J].Chemistry,2002,8:4191-4198.

［14］樊均明,张明华,李静.人参皂苷Rg1(GRg1)对补体诱导的足细胞凋亡的作用[J].全国中西医结合发展战略研讨会，2011.

［15］Jimenez-cervantes C,Perez C.Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress:transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor[J].J Cell Sci,2001,14:2335-2344.

［16］Nagata H,Takekoshi S,Takeyama R,et al.Quercetin enhances melanogenesis byan melanoma cells and increasing the activity and synthesis of tyrosinase in human normal human melanocytes[J].Pigment Cell Res,2004,17:66-73.