孙贝蕾郑宇琼 林玲陈玮莹蔡尔慧 * 陈玮芳*

（1. 汕头大学医学院基础医学实验教学中心，广东 汕 头 515041；2. 汕头大学医学院第一附属医院，广东 汕 头 515041；3. 汕头大学医学院第二附属医院，广东 汕 头 515041）

人体皮肤表皮基底层的黑素细胞由早期胚胎阶段神经嵴分化而成，具有独特结构和功能[1]。黑素细胞重要的功能是合成黑素，这种产物不仅赋于不同人皮肤、头发和眼睛颜色的不同，而且对于机体抵御紫外光照射引起的损伤起着重要作用[2]。

黑素细胞中黑素合成过程需要相关的酶，包括酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)，酪氨酸酶相关蛋白(tyrosinase related protein-1，TYRP-1)和多巴色素异构酶(DOPA chrome tautomerase，DCT)，其中的TYR是关键酶，黑素合成量取决于该酶的含量和活性大小。黑素细胞中合成的黑素以黑素体形式被转运。黑素相关转运蛋白Rab27a是一种小分子G蛋白，这种蛋白可通过其C末端固定于黑素体膜，并和黑素亲和素蛋白(melanophilin)、肌球蛋白Va(myosinVa)构成三联分子复合物[3]，参与黑素细胞中黑素体的转运过程。皮肤色素代谢异常与黑素细胞黑素的合成和黑素体转运的过程密切相关[4]。

中药白芷制剂可应用于临床某些皮肤色素紊乱性疾病如白癜风、银屑病等的治疗[5-7]。但由于白芷的化学成分复杂，其治疗色素紊乱性疾病的作用机制目前尚不明确。白芷含有活性成分呋喃香豆素类化合物，主要有欧前胡素(imperaterin)、异欧前胡素(isoimperaterin)等成分。我们前期的研究探讨白芷的活性成分欧前胡素对黑素细胞的作用，结果表明欧前胡素抑制体外培养人表皮黑素细胞TYR活性并促进转运相关蛋白Rab27a表达，降低黑素细胞中黑素的含量[8]。目前异欧前胡素应用于抗炎方面有一些相关的报道[9-10]，但对于体外人表皮黑素细胞的作用尚不明确。本研究拟探讨异欧前胡素对体外培养人表皮黑素细胞TYR和Rab27a及黑素细胞中黑素含量的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

异欧前胡素化学名为4-(3-甲基丁-2-烯氧基)呋喃并[3，2-g]苯并吡喃-7-酮；分子式为C16H14O4；相对分子质量为270.28，纯度99.9%。中国食品药品检定研究院产品(编号110827-200712)，化学结构见图1。

图1 异欧前胡素的化学结构

1.2 实验方法

1.2.1 人表皮黑素细胞的体外分离与纯化培养体外人表皮黑素细胞从5例年龄为7～20岁健康儿童或青少年包皮环切术切除的新鲜皮肤组织中分离和纯化培养，皮肤标本取自汕头大学医学院第二附属医院 (经知情同意)。本研究方案经汕头大学医学院第二附属医院伦理委员会审核批准。人表皮黑素细胞的体外分离和纯化培养按我们前期研究的方法[11]：取新鲜皮肤组织，PBS清洗，剪成大小约2 mm×10 mm条状，置于1.6 U/mL Dispase II(Gibco，USA) 中4 ℃消化过夜，分离表皮，置于0.25%胰酶-0.02% EDTA中消化，过滤细胞悬液，离心去上清，加入含人表皮黑素细胞生长因子(HMGS)的M-254培养基(Gibco，USA)，调整细胞浓度后接种于25 cm2培养瓶，置37 ℃、CO体积分数为2 5%的培养箱中培养。每3 d更换M-254培养基1次，胰酶差异法纯化和传代培养人表皮黑素细胞。本实验使用第3～5代纯化培养的人表皮黑素细胞。

1.2.2 MTT法测定黑素细胞活力 MTT法测定黑素细胞活力[12]：调整黑素细胞浓度为5×104/mL，接种于96孔板，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养使黑素细胞贴壁生长。将黑素细胞随机分为对照组和实验组，各组设置3个复孔。对照组仅加入M-254培养基，实验组加入含25 μmol/L异欧前胡素的M-254培养基，分别培养48 h后每孔加入5 mg/mL 四甲基噻唑蓝(MTT)(Amresco，USA) 20 μL，继续培养4 h，加入150 μL DMSO，室温避光震荡10 min。置酶标仪(Wellscan K3，KHB labsystems，Finland)测定吸光度D(492)值，数据应用GraphPad Prism 5统计软件分析。

1.2.3 Western blot法检测TYR和Rab27a蛋白按1.2.2方法培养两组黑素细胞48 h后分别收集细胞，加30 μL RIPA裂解液(Pierce，USA)(临用时添加PMSF 10 μL，蛋白酶抑制剂2 μL)提取细胞总蛋白。BCA法定量细胞总蛋白。各取50 μg样品蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将分离的蛋白转移到硝酸纤维素薄膜[13]。TYR检测一抗加入1∶1 000鼠抗人酪氨酸酶单克隆抗体(Abcam，USA)，转运蛋白Rab27a检测一抗加入1∶ 200鼠 抗 人 Rab27a抗 体 (Abcam， USA)， 内 参 照GAPDH蛋白的检测一抗加入1∶4 000鼠抗人GAPDH单克隆抗体(中杉金桥)，4 ℃摇床过夜。第2天分别加入适当稀释的二抗HRP标记山羊抗鼠IgG(碧云天)，室温孵育1 h，加入1∶1 ECL化学发光液A、B液，置于SynGene Genius凝胶成像系统，X光片曝光成像，采用美国Bio-Rad Quantity One软件分析图像灰度值，数据采用GraphPad Prism 5软件分析。

1.2.4 黑素细胞TYR活力测定 黑素细胞TYR活力的测定采用L-多巴氧化法[14]。各组细胞按1.2.2的条件培养48 h后，每孔加入 1% Triton X-100溶液80 μL作用5 min，再加入0.1% L-DOPA溶液20 μL，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养3 h，酶标仪测定吸光度D(492)值，数据分析采用美国GraphPad Prism 5统计软件。

1.2.5 黑素细胞黑素含量测定 黑素含量测定采用NaOH法[15]，操作如下：调节黑素细胞浓度为1×105/mL，接种于6孔板，分组培养同1.2.4，经0.25%胰酶-0.02% EDTA消化后离心弃上清，加入240 μL含10%DMSO的1 mol/L NaOH溶解1 min，80 ℃水浴30 min。置于酶标仪测定吸光度D(492)值，按以下公式计算黑素含量。

黑素的相对含量=D(492)实验组/D(492)对照组×100%

1.3 统计学方法

实验数据分析采用t检验，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 异欧前胡素对黑素细胞形态的影响

倒置显微镜下观察人表皮黑素细胞的形态结果如图2。可见对照组人表皮黑素细胞胞体较大，呈梭形、三角形或菱形，细胞折光性好，有2～4个树状突起(图2A)；实验组人表皮黑素细胞的胞体变小，但树状突起变长(图2B)。

图2 倒置显微镜观察人表皮黑素细胞的形态(×200)

2.2 异欧前胡素抑制表皮黑素细胞活力

MTT法测定黑素细胞活力结果如图3，对照组、实验组黑素细胞的活力分别为100%、82.8%。表明25 μmol/L异欧前胡素作用后，实验组黑素细胞的活力较对照组降低了17.2%，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示25 μmol/L异欧前胡素可抑制表皮黑素细胞的活力。

图3 MTT法检测人表皮黑素细胞的活力

2.3 异欧前胡素对TYR和Rab27a蛋白表达的影响

Western blot法检测黑素细胞TYR和Rab27a蛋白表达的结果见图4A。与对照组比较，实验组黑素细胞TYR的表达降低30.3%(P＜0.01)，而实验组黑素细胞Rab27a蛋白的表达升高31.9%(P＜0.05)(图4B)。提示25 μmol/L异欧前胡素对黑素细胞TYR表达具有抑制作用，而对黑素细胞Rab27a蛋白表达则呈促进作用。

2.4 异欧前胡素对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的作用

结果见表1。25 μmol/L异欧前胡素作用48 h后，实验组黑素细胞TYR活性较对照组降低了25.6%，差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示25 μmol/L异欧前胡素对体外黑素细胞TYR活性具有明显抑制作用。黑素的含量比对照组降低30.9%，差异亦具有统计学意义(P＜0.01)。

表1 异欧前胡素对人表皮黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的作用(n=3)

图4 异欧前胡素对人表皮黑素细胞TYR和Rab7a蛋白表达的影响

3 讨论

异欧前胡素是中药白芷的主要活性成分之一，属于呋喃香豆素类化合物。我们在预实验中测定0、12.5、25、50和100 μmol/L等不同浓度异欧前胡素对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响，结果表明，12.5 μmol/L异欧前胡素作用对于黑素细胞酪氨酸酶的活性影响不明显，25 ～100 μmol/L异欧前胡素抑制黑素细胞酪氨酸酶的活性，但50 和100 μmol/L异欧前胡素可引起不同程度的细胞死亡。故本研究选用最适浓度25 μmol/L异欧前胡素开展研究，结果表明，25 μmol/L异欧前胡素作用于体外培养的人表皮黑素细胞，使黑素细胞的树状突起变长；并抑制人表皮黑素细胞的活力；抑制黑素细胞TYR表达和TYR活性；促进转运相关蛋白Rab27a的表达，降低黑素细胞中黑素的含量。

人体皮肤的颜色主要取决于黑素细胞的数量、黑素的含量、黑素体的分布和转移[4]，皮肤色素异常相关疾病与这些代谢过程的障碍密切相关。异欧前胡素作为中药白芷的主要活性成分，通过抑制黑素细胞的活力、抑制TYR的表达和TYR活性等作用过程，减少黑素细胞黑素合成；并通过促进转运相关蛋白Rab27a的表达，促进黑素细胞中黑素的转运，降低黑素细胞黑素含量。本研究结果可从代谢层面阐明中药白芷应用于皮肤色素紊乱性疾病治疗的作用机制。

Kawasaki等[16]的研究表明，黑素细胞树状突起的数量及长度增加，有利于黑素小体的转运和分布，在树状突起较长的细胞中Rab27a的表达也有所增加。本研究中异欧前胡素使黑素细胞的树状突起变长，并促进转运相关蛋白Rab27a蛋白的表达，降低黑素细胞黑素含量，表明Rab27a蛋白的表达增强有利于黑素细胞黑素体的转运。我们的前期研究表明，白芷的另一活性成分欧前胡素也有促进Rab27a蛋白表达的作用，但使黑素细胞的树状突起变短[8]，提示欧前胡素和异欧前胡素对于黑素细胞黑素体转运和分布的作用存在一定差异。另外，异欧前胡素可促进黑素细胞β-actin的表达，由于β-actin是细胞骨架微丝的主要构成成分，异欧前胡素使黑素细胞树状突起的变长可能与β-actin的表达增强密切相关[17]，

黑素细胞中黑素小体转移的过程需要一些重要的转运相关蛋白，主要有Rab27a、黑素亲和素蛋白和肌球蛋白Va等。Rab27a是一种小分子G 蛋白，可作为肌球蛋白Va识别黑素小体的受体，通过其C末端固定于黑素小体膜；黑素亲和素蛋白作为连接器，以其N-端连接已结合GTP的Rab27a，并以其C-端结合于肌球蛋白Va的C-端；肌球蛋白Va的N-端为动力区，可结合肌动蛋白微丝，并水解ATP提供动力。这3种蛋白质组成复合物，介导黑素细胞中黑素小体的转运[3]。有关异欧前胡素对于黑素亲和素蛋白和肌球蛋白Va 蛋白的作用，仍有待于进一步研究加以阐明。

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