贾明峰 赵龙 席亚明 陈彻 楚惠媛 郭敏 成娟 李明 张豪 傅思武

艰难梭菌(Clostridium difficile)是引起伪膜性肠炎及抗生素相关性腹泻的主要致病菌之一,可产生毒素A和毒素B。毒素A(Tcd A)被认为是艰难梭菌引起疾病发生的最主要的致病因子,对pH值和温度变化具有较强的适应性。毒素A具有肠道毒性、细胞毒性、小鼠致死活性、红细胞凝集活性和血管通透性亢进等多种生物学活性[1]。研究表明Tcd A对肝癌、白血病、结肠癌细胞均具有一定的诱导凋亡、增殖抑制作用[2,3]。本研究主要探讨Tcd A对白血病细胞株K562的增殖、凋亡及相关机制研究,旨在为开发的抗白血病药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人慢性髓性白血病K562细胞株由兰州大学基础医学院实验中心惠赠,于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。艰难梭菌VPI 10463菌株由西北民族大学傅思武教授惠赠,浓度为0.14 mg/ml。

1.2 细胞增殖实验 取对数生长期的K562细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,接种于96孔板内,加入Tcd A,终浓度分别为50、100、200、400、800 ng/ml,以未处理的细胞为对照组,作用24、48、72 h,每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml),培养4h后加入裂解液,放置过夜,振荡,溶解约10～15 min后,酶标仪测定492 nm处吸光度。计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR)。IR=(对照组吸光度－实验组吸光度/对照组吸光度) ×100%。

1.3 PI单染流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期K562细胞,调整细胞浓度为1×106个/ml,实验组加入浓度为800 ng/ml的Tcd A,对照组为等量的未处理细胞悬液,作用48 h后收集细胞。PBS洗涤,重悬细胞于预冷的70%乙醇,4℃固定2 h,PBS洗涤,加入0.5 ml碘化丙锭(20 μg /ml),避光染色30 min,流式细胞仪分析。

1.4 RT-PCR法检测细胞BCL-2,Bax,Egr-1mRNA的表达取对数期生长的细胞,调整细胞浓度为1×106个/ml,实验组分别加入Tcd A,终浓度依次为50、100、200、400、800 ng/ml,对照组为等量的未处理细胞悬液。作用48h后,按照Trizol法提取总RNA,根据cDNA第一链反应试剂盒说明书进行逆转录。以cDNA为模板进行PCR扩增,进行琼脂糖凝胶电泳PCR,BIO-RAD凝胶成像分析仪上观察结果并照相,Quantity One软件分析结果。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖 结果显示,不同浓度的Tcd A作用于K562细胞后均能抑制细胞的增殖,实验组与对照相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。随着TcdA浓度的增大,抑制率逐渐增加,呈剂量依赖性(表1)。Tcd A浓度为800 ng/ml,作用48 h时的抑制率最大,为47.67%,半数抑制浓度(IC50)约为 375.83 ng/ml。

表1 Tcd A对K562细胞的增殖抑制作用(±s,n=3)

表1 Tcd A对K562细胞的增殖抑制作用(±s,n=3)

注：与对照组相比*P＜0.05

TcdA(ng/ml) 24h 48h 72h A492nm IR(%) A492nm IR(%) A492nm IR(%)0 0.412±0.011 - 0.675±0.016 - 0.752±0.023 -50 0.311±0.002 24.51* 0.544±0.012 19.40* 0.689±0.007 8.38 100 0.299±0.015 27.42* 0.512±0.004 24.15* 0.641±0.009 14.76 200 0.268±0.008 34.95* 0.461±0.009 31.71* 0.609±0.006 19.02*400 0.241±0.002 41.50* 0.381±0.005 43.56* 0.596±0.005 20.74*800 0.229±0.004 44.41* 0.360±0.004 47.67* 0.587±0.006 21.94*

图1 Tcd A对K562细胞凋亡的影响

2.3 RT-PCR检测K562细胞内Bcl-2,Bax,Egr-1 mRNA的表达。

不同浓度的Tcd A作用于K562细胞48h后,随着药物浓度增加,Bcl-2基因mRNA的表达量逐渐下降,Bax基因mRNA的表达量逐渐增加,Egr-1基因mRNA的表达量逐渐增加。运用Quantity one软件分析各条带灰度值,实验组与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 2)。

图2 Tcd A对K562细胞Bcl-2,Bax,Egr-1mRNA表达的影响

3 讨论

Tcd A是一种外毒素,通过受体介导的内吞作用进入细胞而发挥细胞毒作用。本研究显示,不同浓度的TcdA对白血病K562细胞均有较强的增殖抑制作用,作用48 h时的抑制率达到47.67%,并随着药物剂量的增大抑制率逐渐增大,呈剂量依赖性。流式细胞仪检测结果提示,给药48 h后正常细胞的二倍体峰前出现明显的亚二倍体峰,即凋亡峰。因此TcdA能诱导K562细胞发生凋亡。

细胞凋亡是细胞在凋亡基因的调控下,启动内源性核酸内切酶而发生的程序性死亡[4]。线粒体/细胞色素C介导的细胞凋亡途径是主要细胞凋亡途径之一。细胞在凋亡信号如DNA损伤、神经酰胺、Ca2+过载等刺激下,线粒体膜通透性改变,释放细胞色素C,进而在ATP/dATP存在下,与Apaf-1、Caspase-9前体形成凋亡体,诱导procaspase活化,进而激活Caspase-3,最终导致细胞凋亡。现普遍认为,细胞色素C的释放与Bcl蛋白家族成员有关。Bcl蛋白家族分为两类,一类是抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcll、Bcl-w等),另一类是促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bid和Bad等)。细胞在受到各种刺激后,线粒体外膜间的通透转变孔道开放,基质和胞浆内的离子得以平衡流动,线粒体基质呈现高渗状态,线粒体肿胀,外膜破裂,膜间隙中的促凋亡蛋白释放,引起细胞凋亡[5]。Bcl-2蛋白则减少Ca2+的释放,防止线粒体发生肿胀,抑制细胞色素C的释放。而Bax等促凋亡蛋白通过直接或间接途径形成Bax的异源/同源二聚体,促进通透转变孔道开放。抗凋亡蛋白Bcl-2等过表达,与Bax蛋白形成异源性二聚体,抑制通透转变孔道开放[6]。因此人们认为抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的失衡是肿瘤发生的机制之一[7]。本研究中,艰难梭菌毒素A作用K562细胞48h后,随着药物浓度的增加,Bcl-2 mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调。

Egr-1基因为即刻早期反应基因,位于人类5号染色体q23-31,具有诱导细胞增殖、分化,促进细胞凋亡等多种生物学作用。而其诱导细胞凋亡的机制主要是调节TGFβ的表达,诱导野生型P53和下调Bcl-2基因的表达。孔灵玲等[8]将外源性的Egr-1质粒导入乳腺癌细胞株后,研究发现,随着Egr-1表达的增加,caspase-3表达水平增加,p-gp表达水平下降,细胞发生显著地凋亡。本研究结果显示,随着TcdA浓度的增加,Egr-1基因的表达水平增加,且与Bcl-2 的表达呈负相关。

综上所述,TcdA作用于白血病K562细胞株,能够抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡。而其机制与Bcl-2表达下调,Bax以及Egr-1的表达上调有关。艰难梭菌毒素A作用于白血病细胞,是否还有其他机制参与,需要我们更加深入的研究。

[1] Baierlein,S.A.,A.Wistop.Clostridium difficile].N Engl J Med,2009.360(6): 636-7;author reply 637-8.

[2] Kushnaryov,V.M.,P.N.Redlich,et al.Cytotoxicity of Clostridium difficile toxin A for human colonic and pancreatic carcinoma cell lines.Cancer Res,1992,52(18): 5096-9.

[3] 李明,席亚明,陈彻,等.TcdA对K562细胞生长增殖的影响.中国实验血液学杂志,2011,(4): 894-897.

[4] 王海丽,魏武,纪爱芳,等.马钱子碱对人白血病细胞株K562细胞的诱导凋亡作用.中国实验血液学杂志,2011,(3): 630-633.

[5] SL,H.Mitochondrial function in apoptotic neuronal cell death.Neurochemical Research,2004,29(3).

[6] Wang,S.J.,X.Guo,et al.Chondrocyte apoptosis and expression of Bcl-2,Bax,Fas,and iNOS in articular cartilage in patients with Kashin-Beck disease.J Rheumatol,2006,33(3):615-9.

[7] 晁荣,靳蕊蕊,陈彻,等.大黄素诱导白血病KG-1a细胞凋亡及对Bcl-2/Bax mRNA表达的影响.第三军医大学学报,2012,34(13):34.

[8] 孔灵玲,崔文,肖兰,等.EGR-1在乳腺癌细胞株中的表达.济宁医学院学报,2009,(1): 4-5.