范治军 李科 刘士煜 王焕坤

茶多酚是茶的有效成分,对多种肿瘤细胞具有直接杀伤作用,并能提高放疗的敏感性,其增敏机制可能与影响细胞周期及诱导细胞凋亡有关。本文通过体外培养鼻咽癌细胞,分为单纯放疗与放疗加茶多酚两组,用MTT法观察两组细胞生长的抑制情况,用流式细胞仪检测两组间细胞周期的改变,及用电子显微镜观察两组细胞发生凋亡的情况,介绍如下。

1 材料

1.1 实验对象 人鼻咽低分化鳞状上皮癌细胞系CNE-2。

1.2 试剂 茶多酚、小牛血清、PBS液、1640培养液、胰酶消化液。

1.3 器材 CO2培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、流式细胞仪、电子显微镜

2 方法及观察指标

2.1 细胞培养 将CNE-2细胞培养于含有新生小牛血清,青霉素、链霉素各100 U/ml及碳酸氢钠调节pH值至7.2～7.4的1640培养液中,置于37℃恒温5% CO2培养箱中培养,收集对数生长期细胞进行实验。

2.2 照射方法 将细胞接种于培养板中,贴壁后用直线加速器6MV线照射。照射条件：剂量率108～111 cGy/min,放射源距细胞生长面80 cm,机头和机架角度均为0,细胞上方培养液深度5 mm,作为照射所需剂量的建成区,照射野大小30 cm×30 cm,照射细胞摆放位于照射野边缘2 cm以内的区域。

2.3 MTT法检测细胞抑制情况 将细胞接种于96孔板,贴壁后加入浓度依次5、10、15、20、25、30 μg/ml的茶多酚培养48h,检测前加MTT,培养4 h,加DMSO,全自动酶标仪比色检测,测吸光度A值。计算半数抑制浓度(IC50),用IC50浓度的茶多酚作用肿瘤细胞,分为单纯放疗组和放疗加茶多酚组,并设空白对照,在第1到第4天依次用MTT法比色检测,观察两组间细胞生长抑制率的差异。细胞生长抑制率(%)=(对照组A-实验组A)/对照组A×100%。

2.4 流式细胞仪分析细胞周期 将细胞接种于培养板中,贴壁后分单纯放疗和放疗加茶多酚两组,后组所加茶多酚为上述IC50的浓度,药物作用24 h后,分别用直线加速器照射细胞,照射后再培养24 h,按照流式细胞仪检测前标本准备流程处理细胞,上机检测分析细胞周期,收集数据,在MultiCycle分析软件进行细胞周期分析,计算G1、S、G2/M期的相对比例。

2.5 电子显微镜观察细胞凋亡 将细胞接种于培养板中,贴壁后分为单纯放疗组和放疗加茶多酚组,其中后组所加茶多酚为上述IC50的浓度,药物作用24 h后,分别用直线加速器照射细胞,照射后再培养24 h,按照电子显微镜标本常规制作方法处理标本,在透射电镜下观察细胞。

2.6 统计学方法 数据用SPSS12.0软件进行统计学处理,采用t检验和成组单因素方差(One-way ANVOA)分析,(P＜0.01)或(P＜0.05)为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT法检测结果 不同浓度茶多酚作用48 h对CNE-2细胞增殖的影响。见表1。

表1 不同浓度茶多酚作用48 h对CNE-2细胞增殖的影响(±s)

表1 不同浓度茶多酚作用48 h对CNE-2细胞增殖的影响(±s)

注：与对照组相比▲P＜0.01,所测IC50=22.94 μg/ml

组别 OD(无密度) 值抑制率对照组 0.345±0.013 5 μg/ml 0.329±0.014 4.6%10 μg/ml 0.315±0.002 8.6%15 μg/ml 0.310±0.003 10.0%20 μg/ml 0.268±0.034 21.9%25 μg/ml 0.159±0.007▲ 53.8%30 μg/ml 0.027±0.009▲ 92.0%

两组随时间延长对CNE-2细胞增殖的影响。见表2。

3.2 细胞周期检测结果 G2/M期比例下降有统计学意义。见表3。

表2 随时间延长2组对CNE-2细胞增殖的影响(±s)

表2 随时间延长2组对CNE-2细胞增殖的影响(±s)

注：单纯放疗组与茶多酚加放疗组相比★P＜0.05,▲P＜0.01

时间(d) 空白对照组 单纯放疗 茶多酚加放疗OD值 OD值 抑制率 OD值 抑制率1 0.286±0.008 0.138±0.007 52.1% 0.104±0.006 63.5%2 0.345±0.013 0.184±0.003 46.5%★ 0.159±0.007★ 53.8%3 0.579±0.050 0.274±0.008 52.7%▲ 0.222±0.025▲ 61.2%4 0.725±0.028 0.287±0.006 60.3%▲ 0.150±0.013▲ 79.8%

表3 两组间细胞周期的差异(±s)

表3 两组间细胞周期的差异(±s)

单纯放疗组与茶多酚加放疗组相比★P＜0.05

组别 G1(%) S(%) G2/M(%)空白对照组 56.4±3.2 12.5±5.5 32.3±4.5单纯放疗组 55.7±5.2 32.1±4.2 12.1±2.6★茶多酚加放疗组 67.2±4.8 26.5±6.3 5.1±1.9★

3.3 透射电镜观察显示 单纯放疗组在照射24 h后出现核膜稍完整,胞浆空泡化,染色体聚集成团块状,在核周围产生凋亡小体(图1)；茶多酚加放疗组在照射24 h后细胞核结构不清,细胞凋亡明显,大量凋亡小体产生(图2)。

图1

图2

4 讨论

大量研究显示茶多酚在体外有抗肿瘤作用[1],本实验中,通过MTT法显示茶多酚对鼻咽癌细胞CNE-2的生长有抑制作用,在48 h内,随着剂量的增加,抑制作用逐渐增强。有实验显示茶多酚具有放疗增敏作用[2-4],本文中实验分单纯放疗和放疗加茶多酚两组,通过MTT法显示,随着时间延长,抑制作用逐渐增加,且放疗加茶多酚组抑制作用强于同时间的单纯放疗组。通过流式细胞仪检测细胞周期,观察到茶多酚加放疗组,进入G2/M期的细胞比例较单纯放疗组更加减少,说明其提高了放射敏感性,因为放疗主要对G2/M期细胞杀伤作用显著,可见由于茶多酚的加入,使得大量G2/M期细胞被杀灭,因而G2/M期的细胞比例减少明显。在电镜下观察发现,由于茶多酚的加入,使照射后的细胞发生凋亡的时间缩短,发生凋亡的细胞增多。茶多酚提高放疗敏感性可能与调节细胞周期以及诱导凋亡有关,茶多酚可以通过抑制细胞周期素的表达,导致细胞周期素依赖激酶活性的变化,改变细胞周期[5]。亦可以诱导p53的表达,p53与特定序列的DNA结合,促使细胞周期发生改变[6]。茶多酚能参与调控某些癌基因或抑癌基因的表达,能抑制促癌剂引起的癌变正相关基因的表达,诱导细胞凋亡[5]。还可能在体外诱导细胞凋亡的途径是由于DNA拓扑异构酶II受到抑制所体现[7]。本实验仅通过体外实验初步观察到茶多酚对放疗的增敏作用,尚需通过体内大量实验进一步观察和验证。

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[6] 袁健,孙宁.细胞周期与鼻咽癌的放射增敏.海南医学院学报,2004,10(3):139.

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