张文军，黄志文，李喜芳，张成成，刘映乐

(1.广东药学院病原生物学与免疫学系，广东广州510006;2.武汉大学病毒学国家重点实验室，湖北武汉430072)

核糖核酸酶P(RNase P)是广泛存在于各类生物细胞中的一种天然核酶，主要参与tRNA前体(ptRNA)5'末端的切割［1］。大肠埃希菌 RNase P最早被发现、结构也相对最为简单，仅由一个含377 nt的RNA亚基(M1 RNA)和一个约14 kd的蛋白亚基组成。其中，M1 RNA亚基最为保守，是催化RNA切割的活性所在［2］。研究表明，RNase P(或 M1 RNA)识别底物特定的二级结构，只要底物具备5'单链区、双螺旋区和3'CCA结构即可被其识别并切割［3］。因此，对于任何已知序列的靶RNA，均可设计一小段引导序列(guide sequence，GS)与其互补结合，并形成RNase P识别的底物结构，从而被特异性切割，由此发展出一类基于RNase P的新型反义技术。该技术在抗感染及抗肿瘤等研究领域有着较为广泛的报道［4－7］。

丙型肝炎病毒(HCV)是一种单链正RNA病毒，基因组全长约9.6 kb［8］。据统计，全球范围内HCV感染者超过1.7亿，大部分急性HCV感染将发展成为慢性，并最终导致肝硬化、肝衰竭乃至肝癌［9］。由于缺乏有效的HCV疫苗，临床上干扰素联合病毒唑的治疗方案应答率不高且易反复。因此，发展新型抗HCV治疗策略显得较为迫切。本研究针对 HCV基因组保守的调控区域——5'UTR，设计GS序列，并进一步将其共价连接于M1 RNA的3'末端，成功构建了一种靶向性核酶(M1GS-HCV/C67)，结果证实该人工核酶具有显著的胞外靶向切割活性及胞内抗病毒作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒及核苷酸片段:pGEM-3Z、pFL117质粒(暨南大学周天鸿教授惠赠);pUC19质粒和大肠杆菌JM109菌株(北京鼎国生物技术有限公司);pGEM-HCV/core重组质粒(本实验室构建);引物(英潍捷基生物技术有限公司合成)。

1.1.2 酶及试剂:限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、绿豆芽核酸酶、T4 DNA连接酶、T7 RNA聚合酶和DNaseⅠ(天宝生物工程有限公司);质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒(Biomiga公司);脂质体(Lipofectamine2000)和HCV核酸定量检测试剂盒(上海科华生物工程有限公司)。

1.1.3 细胞及病毒:Huh7.5.1细胞系和HCV JFH-1病毒株(武汉大学吴建国教授惠赠)。

1.2 方法

1.2.1 M1GS-HCV/C67重组质粒构建:1)GS的设计:候选靶位一般应具备以下序列特征［10］:①切割位点的3'和5'分别是一个鸟嘌呤(G)和一个嘧啶(U/C);②切割位点下游第8位是尿嘧啶(U);③靶位处二级结构应相对简单，以利于GS与之结合。通过 DNAMAN与 RNA Structure4.5软件对HCV RNA 5'UTR的序列与结构进行分析，发现第67位胞嘧啶(C)与第68位鸟嘌呤(G)之间为潜在的切割位点(C67)。基于C67靶位两侧的序列，GS序列设计为:5'-AGACGCTTTCTGCCCA-3'(表1)。2)M1GS核酶基因的制备与克隆:以含 M1 RNA基因的pFL117质粒为模板，通过PCR扩增直接可获得含M1GS核酶的基因片段。引物P1和P2限定的PCR产物，为包含一段长88 nt桥序列的M1GS核酶基因(M1GS-HCV/C67);引物P1和 P3限定的PCR产物，则为不包含桥序列的M1GS核酶基因(M1GS-HCV/C67*)。在此基础上，分别将上述两种PCR扩增产物克隆至pUC19载体多克隆位点EcoRⅠ和HindⅢ之间，从而构建M1GS核酶基因的重组质粒。

1.2.2 M1GS核酶及靶RNA片段制备:M1GS核酶基因克隆质粒首先以限制酶HindⅢ线性化，再以绿豆芽核酸酶平滑末端，然后在T7 RNA聚合酶的催化下进行体外转录，即可制备M1GS核酶RNA。具体方案参照使用说明书。转录产物依次以DNA酶I消化30 min、苯酚氯仿抽提1次、乙醇沉淀2次，保存于80%乙醇中备用。pGEM-HCV/core质粒为本实验室自行构建的重组质粒，含HCV基因组5'端的基因片段(nt 1～584)。以该质粒作模板，通过32P-UTP掺入的体外转录，制备放射性核素标记的靶RNA片段，具体见文献［11］。

1.2.3 胞外切割实验:32P标记的靶RNA，80℃热变性3 min、冰浴1 min，加入等摩尔的M1GS核酶RNA;37℃温育30 min后，加入等体积含9 moL/L尿素、0.05%溴酚蓝及0.05%二甲苯蓝的终止液终止反应，以8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (含7 mol/L尿素)进行分离，最后以X线片放射自显影。

1.2.4 胞内抗病毒作用测定:Huh7.5.1细胞以DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养，待细胞丰度长至约80% ～90%时，以JFH1病毒株感染，MOI为1.0。感染后2 h，以无血清培养基洗涤2次，再以Lipofectamine 2000将M1GS核酶转染入细胞。设立M1GS-HCV/C67实验组、M1GS核酶对照组(M1GSHCMV/UL97及M1GS-HCV/C67*)和空白组。转染的方法按照试剂操作说明书。细胞转染48 h后，以Western blot检测HCV核心蛋白的表达。此外，分别收获感染后4、24、48、72和96 h的细胞培养上清，以丙肝病毒核酸定量检测试剂盒检测HCV RNA的拷贝数，评价M1GS核酶对病毒增殖的影响。

2 结果

2.1 M1GS-HCV/C67核酶基因(图1)

2.2 M1GS-HCV/C67核酶基因克隆鉴定

如图2所示，对克隆的M1GS核酶基因进行PCR扩增，可见一条明显的特异性扩增产物条带。此外，以限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对克隆质粒进行双酶切鉴定，可见M1GS-HCV/C67和M1GSHCV/C67

*质粒均可被切割产生大、小两个片段，大片段应为pUC19载体，小片段应为M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C67*核酶基因片段，与预期大小相符。

2.3 体外转录产物鉴定

转录产物以8%聚丙烯酰胺电泳(含7 mol/L尿素)分离后进行银染(图3)。可以看出，无论是M1GS核酶或者是HCV靶RNA片段，均只有一条明显的条带。这表明该反应体系中的转录产物纯度高。此外，无桥序列的核酶 M1GS HCV/C67*长410 nt;M1GS HCV/C67核酶长498 nt，HCV 靶 RNA片段长约590 nt。从图中泳动位置看，各条带分别与其预期大小相当。因此，转录的特异性也较好。

表1 M1GS核酶基因的引物及其序列Table 1 Sequence of the PCR primers for the gene of M1GS ribozyme

图1 M1GS核酶基因的结构图Fig 1 Schematic structure of the genes that coding for M1GS ribozymes

2.4 M1GS核酶体外切割活性检测

与对照组相比，核酶M1GS-HCV/C67可以对底物RNA切割，产生两条明显的新条带。5'切割产物大小约80 nt，3'切割产物大小约510 nt。从切割产物条带的位置，符合预计大小，表明该切割发生于C67靶位。而在对照组，非HCV靶向性核酶(M1GS-HCMV/UL97)以及缺乏桥序列的M1GS核酶(M1GS-HCV/C67*)均不能对底物RNA产生切割(图4)。

2.5 M1GS核酶胞内抗病毒作用测定

与空白组相比，转染M1GS-HCV/C67核酶的细胞，HCV核心蛋白表达量明显减少(P＜0.05);而转染M1GS-HCV/C67*核酶以及转染M1GS-HCMV/UL97核酶，核心蛋白的表达量均无明显减少(图5)。进一步测定M1GS核酶对HCV病毒增殖的影响。通过荧光定量PCR 测定不同时间(4、24、48、72和96 h)培养液中HCV RNA的拷贝数，变化曲线如图6所示，M1GS-HCV/C67核酶可极显著地抑制HCV病毒的增殖(P＜0.01)。在感染1 d后，可使HCV RNA的拷贝数降低约800倍，而M1GS HCV/C67*核酶则不能显著抑制HCV病毒的增殖。

3 讨论

图6 HCV的增殖曲线Fig 6 The growth curve of HCV

有研究证实，RNase P识别的是底物特定的高级结构而非一级结构序列，底物RNA中的少量突变只要不影响特定的结构基序，仍可被RNase P识别并特异性切割［12］。因此，这种基于RNase P的反义技术对于抑制易变异基因的表达方面，具有其独特优势。目前，基于RNase P的反义技术主要有外源引导序列(external guide sequence，EGS)和M1GS核酶这两大类型［13］。众所周知，HCV变异迅速，属于准种病毒［14］。本研究采用M1GS技术对HCV进行研究，将HCV的抗病毒治疗开辟一条极具潜力的新途径。M1GS-HCV/C67是针对HCV保守区5'UTR的一种人工靶向性核酶，其结构与作用原理如图7所示。

相比于EGS技术，M1GS核酶3'端的 GS可通过与相应靶RNA结合，并可直接引导与其相连的M1 RNA对底物进行切割，理论上其切割效率更高。实验结果表明，M1GS-HCV/C67核酶不仅可在胞外对HCV 5'UTR产生明显的切割作用，而且能够使HCV感染的Huh7.5.1细胞核心蛋白的表达量显著下降(P＜0.05)。与此同时，也将使培养液中HCVRNA的拷贝数显著减少(P＜0.01)。上述结果显示M1GS-HCV/C67核酶在胞内有效抑制HCV的增殖，是抗HCV研究中一种极具潜力的反义分子。

图7 M1GS核酶与底物的相互作用Fig 7 Interaction between the M1GS ribozyme and its substrate RNA

在构建M1GS-HCV/C67核酶的同时，也构建了另一个缺乏连接桥序列的M1GS核酶(M1GS-HCV/C67*)。该核酶针对的靶位与M1GS-HCV/C67完全相同，但却没有切割活性，也不能再宿主细胞内抑制HCV的基因表达及病毒的增殖。这不仅进一步证实桥序列对于M1GS核酶的活性至关重要，同时也为M1GS核酶抗病毒作用的研究提供了一种较为理想的内参对照。

总之，本研究构建的M1GS-HCV/C67核酶为新型抗HCV药物及反义基因治疗的研究提供了依据。然而，它在动物模型中是否具有抗病毒效应，尚有待进一步的证实。此外，还有必要对该M1GS核酶进行适当的化学修饰(如硫代化、烷基化及胆固醇化等)，以提高其稳定性及细胞透过性，并对M1GS核酶在胞内或体内的毒性及代谢动力学进行深入探讨。

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