刘 亚，田红燕，闫晓丽，王文平，范粉灵

(西安交通大学医学院第一附属医院心内科，陕西西安710061)

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是以肺循环阻力进行性升高，并最终导致右心功能不全为特点的一组慢性疾病，具有进展迅速，预后差的特点［1］。肺动脉结构的重塑是肺动脉高压的重要病理改变。既往认为，肺动脉重塑是肺动脉局部细胞大量增殖、堆积的结果。然而，肺动脉细胞凋亡减少也是肺动脉高压血管重构的重要原因，且与肺动脉内丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)增加有关［2］，但肺动脉细胞凋亡减少的原因和机制目前还不清楚。肺动脉高压时，肺动脉内皮细胞释放前列环素减少，导致肺动脉平滑肌细胞增殖增加，是肺动脉重塑的原因［3］。然而，前列环素对肺动脉重构的促进作用是否还与其减少后抑制肺动脉细胞凋亡有关呢?本研究以贝前列素(beraprosat)为对象，观察前列环素对肺动脉凋亡的影响，希望为进一步认识肺动脉肺高压的病理机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂

野百合碱(Sigma公司)，Beraprosat(北京泰德制药股份有限公司)，TUNEL试剂盒(Promega公司)，Trizol(Invitrogen公司)，RNA反转录试剂盒(Fermentas公司)，RT-PCR试剂盒(Takara公司)，GAPDH抗体(Epitomics公司)，BAX及BCL-2抗体(Cell Signaling Technology公司)，PDK(Enzo Life Sciences公司)，山羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 实验动物

清洁级雄性SD大鼠30只，体质量180～250 g［西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号:SCXK(陕西)2007-001］，随机均分为对照(control)组(n=10)、野百合碱 (MCT)组(n=10)及贝前列素(beraprosat)组(n=10)。MCT及beraprosat组给予MCT 60 mg/kg腹腔注射，control组给予等体积0.9%氯化钠注射液腹腔注射。第2天起，beraprosat组每天给予 Beraprosat 200 μg/kg灌胃，control及MCT组给予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃，直至第21天。

1.3 肺动脉血流动力学及右心肥厚指数测定

测量肺动脉压力，称量右心室(RV)、左心室及室间隔的重量(LV+S)，计算右心肥厚指数=RV/(LV+S)。

1.4 留取组织标本

分离大鼠左肺2～3级肺动脉，液氮保存。分离大鼠右肺下叶，4%多聚甲醛固定8 h后，采用20%蔗糖浸泡过夜，OCT包埋，冰冻切片机将组织切成10 μm组织切片。

1.5 肺动脉结构的观察

将组织切片行HE染色，选取外径50～200 μm的肌性小动脉，观察动脉管壁厚度。动脉管壁厚度(%)=(血管外径－血管内径)/血管外径×100%

1.6 肺动脉细胞凋亡观察

采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP缺口末端标记技术(TUNEL)，观察肺动脉细胞凋亡。

1.7 实时荧光定量PCR(RT-PCR)

采用Trizol法提取肺动脉总RNA，将RNA反转录为cDNA，采用RT-PCR检测目的RNA水平。引物序列如下:GAPDH:5-AGAACATCATCCCTGCAT CCA，5-GCCTGCTTCACCACCTCTTG;BAX:5-GGA GATGAACTGGACAATAATATG，5-CAAAGTAGAAGA GGGCAACC;BCL-2:5-GCAGAGATGTCCAGTCAG，5-CAGAGCGATGTTGTCCAC;PDK:5-CGACAGACTC TTCAACTAC，5-AGCCTTAATATAGATGACAGC。

1.8 Western blot

提取肺动脉总蛋白，蛋白变性，使用12%的SDS-PAGE分离蛋白;采用半干转方法将蛋白转印至NC膜上，使用5%脱脂牛奶室温封闭NC膜1 h;封闭完成后，漂洗NC膜，并在其上加入一抗于4℃过夜;次日清晨，漂洗NC膜，加入二抗室温1 h;二抗孵育结束后，显色。一抗浓度分别为:抗GAPDH 1∶1 000;抗 BAX 1∶1 000;抗 BCL-2 1∶1 000;抗 PDK 1∶1 000，一抗均为兔抗大鼠，二抗为山羊抗兔，使用浓度为1∶5 000。

1.9 统计学分析

实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(±s)，3组之间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 贝前列素对肺动脉压力的影响

MCT组大鼠平均肺动脉压力(mPAP)和右心肥厚指数均显著升高(P＜0.05)，贝前列素组显著回降(P＜0.05)，接近正常组水平(表1)。

2.2 贝前列素对肺动脉结构的影响

MCT组大鼠肺动脉壁厚度显著增加(P＜0.05)(图1)，肺动脉内细胞凋亡显著减少(P＜0.05)(图2)，贝前列素干预使肺动脉壁厚度显著回降(图1)、肺动脉内凋亡细胞显著回升(P＜0.05)(图2)。

2.3 贝前列素对BAX，BCL-2及PDK mRNA的影响

MCT组大鼠肺动脉内BAX mRNA水平显著降低(P＜0.05)，BCL-2和PDK mRNA水平显著增加(P＜0.05)，贝前列素组BAX mRNA水平显著回升(P＜0.05);BCL-2及PDK mRNA显著回降(P＜0.05)(图 3)。

表1 贝前列素对肺动脉压力和右心肥厚指数的影响Table 1 The role of beraprosat on mPAP and right ventricular hypertrophy index(x ± s，n=7)

图1 贝前列素对肺动脉壁的影响Fig 1 The role of beraprosat on pulmonary artery wall thickness(n=7)(×400)

2.4 贝前列素对BAX，BCL-2及PDK蛋白表达的影响

MCT组大鼠肺动脉内BAX蛋白水平显著降低(P＜0.05)，BCL-2和PDK蛋白水平显著升高(P＜0.05)，贝前列素使BAX蛋白水平显著回升(P＜0.05)，BCL-2及 PDK蛋白水平显著回降(P＜0.05)(图4)。

图4 贝前列素对BAX、BCL-2及PDK蛋白水平的影响Fig 4 The role of beraprosat on the protein level of BAX，BCL-2 and PDK(n=7)

3 讨论

前列环素(PGI2)是膜磷脂释放的花生四烯酸代谢产物，主要由血管内皮细胞产生［4］。在肺动脉，内皮细胞产生PGI2，引起平滑肌细胞舒张，抑制平滑肌细胞增殖。肺动脉高压时，内皮细胞损伤，释放PGI2减少，肺动脉平滑肌细胞收缩和增殖，肺动脉重塑［3］。前列环素类药物是最早应用于肺动脉高压靶向治疗的药物，通过补充外源性的前列环素达到有效降低肺动脉压力和改善肺动脉重塑的作用［5］。Beraprost是首个口服前列环素类药物，虽然用于肺动脉高压治疗的长期疗效还有争议，但是，贝前列素与其他肺动脉高压治疗的靶向药物联用较单独使用这些药物有着更好的效果，可能与其不同的作用机制有关［6］。

肺动脉高压时，肺动脉重塑的形成是肺动脉内各种细胞增殖增加与凋亡减少共同作用的结果［7］，细胞内PDK增加，抑制线粒体代谢［8］，阻止线粒体内膜 BAX和BCL-2释放到细胞质，抑制细胞凋亡［2，9］。

本研究发现，MCT肺动脉高压大鼠肺动脉内细胞凋亡减少，肺动脉内BAX降低，BCL-2和PDK升高，贝前列素在预防MCT诱导肺动脉压力升高、肺动脉重塑过程中，伴有肺动脉内细胞凋亡的增加。同时，贝前列素干预使肺动脉内BAX回升，BCL-2和PDK回降。因此，贝前列素改善肺动脉重构的作用可能与其促进肺动脉细胞凋亡有关。

这可能是因为:PGI2除与细胞膜上的PGI2受体结合外，还能与核受体PPAR结合［4］，通过细胞内BAX 和 BCL-2［10］，促进多种细胞［11－12］凋亡。贝前列素钠在促进肺动脉细胞凋亡的过程中，也伴有BAX和BCL-2凋亡途径的异常，故推测，贝前列素促进细胞凋亡可能与活化细胞内PPAR有关，但具体机制还有待研究。

综上所述，本研究发现，贝前列素可以通过促进肺动脉细胞凋亡改善肺动脉高压的肺血管重塑，但是其具体机制还有待于进一步的研究。

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