李武县，梁勤东，董晋豫，王 秦，戴 勇，2，涂植光，徐 勇，3*

(1.重庆医科大学教育部临床检验诊断学重点实验室，重庆400016;2.深圳市人民医院临床医学研究中心，广东深圳518020;3.深圳市坪山新区人民医院临床医学研究中心，广东深圳518118)

唐氏综合征(Down syndrome，DS)，又名21-三体综合征，常伴有智力低下、特殊面容、免疫缺陷等80多种临床症状［1－2］。关于DS患者各临床症状的产生，大部分研究学者认为是21号染色体和2倍体基因表达紊乱的共同作用结果［3］。而21号3染色体基因如何导致2倍体基因表达紊乱、扰乱正常发育，产生各种临床有害表型的机制仍不清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小的、长度为18～24个核苷酸(nucleotides，nt)的内生性单链非编码RNA。他们可与其靶基因mRNA的3'-端特异性结合，使靶基因mRNA降解或抑制靶基因编码蛋白的表达，在基因转录后表达调控中具有重要作用，是一种有效的基因表达调控因子［4］。已有研究证明21号染色体miRNA基因的过表达与DS相关临床表型的发生和发展密切相关［2］。因此，鉴别与DS各临床表型相关miRNA的表达谱和染色体分布特征，将有助于了解DS疾病临床表型发生发展的分子调控机制，为进一步研究DS患者全基因组基因表达紊乱及其与相关临床症状的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验脐带血标本由深圳市人民医院临床医学研究中心遗传室提供，标准型DS胎儿脐带血6例(2男性，4女性)，正常胎儿脐带血6例(2男性，4女性)，分别设为DS组和对照组。每例样本均由常规G显带染色体核型分析确诊，孕周18～22周，孕妇年龄30～44岁。该研究经深圳市人民医院伦理委员会批准，且征得所有孕妇知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本的处理:按照单个核细胞提取标准步骤，运用淋巴细胞分离液(Invitrogen公司)提取1 mL EDTA抗凝脐带血单个核细胞，溶入1 mL Trizol试剂(Invitrogen公司)混合均匀，置于冻存管中，冻存于－80℃备用。

1.2.2 总RNA的提取:将冻存样本常温下解冻，按照Trizol试剂盒(Invitrogen公司)操作说明提取总RNA。经Agilent 2000 Bioanalyzer分析仪检测合格后(RIN≥8.0且28 S/18 S＞1.5)，用于 small RNA建库Illumina测序分析。

1.2.3 Small RNA文库构建和Illumina测序:分别等量混合DS组和对照组胎儿脐带血单个核细胞RNA(总量≥10 μg)，构建small RNA文库。先用15%PAGE电泳分离混合RNA样本，回收纯化18～30 nt长的small RNA分子。在T4 RNA连接酶作用下，给small RNAs分子加上3'adaptor和5'adaptor，再由RT-PCR扩增生成 small RNA文库，运用Illumina HiSeqTM2000测序仪进行深度测序分析。文库的构建和测序均在深圳华大基因研究院的协助下完成。

1.2.4 Small RNA数据处理和注释:首先对Illumina测序所得序列进行去adaptor、去低质量、去污染、去冗余等处理，获得高质量干净序列并进行长度分布分析;再运用SOAP(2.0)软件将高质量干净序列与相关数据库［repeatmarker、genbank、rfam(10.0)、UCSC和piRNA数据库］进行序列比对分类注释(碱基错配 ≤2)，尽可能去除重复序列，rRNA，tRNA，mRNA降解片段，scRNA、snoRNA、snRNA、piRNA 等非编码RNA序列;再将余下序列与miRNA数据库(miRBase17.0)中人miRNA序列比对，获取两组样本已知miRNA的含量、表达丰度和染色体分布等信息。

1.2.5 两样本miRNA表达差异比较:首先对两组样本表达miRNA作归一化处理，使每个miRNA的表达量处于同一个量级［公式:归一化表达量(TPM)=miRNA表达量/样品总表达量×106］;再利用Audic and Claverie test统计学方法比较两组样本miRNA的表达差异，并计算P值［5］。若miRNA在两组样本间的倍比值≥2且P＜0.001，则认为该miRNA在两组样本间的表达差异显著;若miRNA归一化后在两组样本中的表达量都小于10 TPM，则该miRNA不参与差异表达分析。

1.2.6 两样本miRNA染色体分布:为研究两组样本表达miRNA编码基因的染色体分布，根据miRBase17.0(http://www．mirbase．org/)人类 miRNA注释基因，作如下处理:1)对miRNA基因表达产物作如上归一化处理，使两组样本miRNA基因表达水平处于同一量级;2)筛除多染色体多位点miRNA编码基因;3)若一个miRNA基因在两组样本中同时表达成熟体miRNA和miRNA*(miRNA*:miRNA功能单链的互补链)，或miRNA-5p和miRNA-3p(新的miRNA命名，分别位于同一miRNA基因的5'和3'端)，则取两者较高值进行统计。

1.2.7 Stem-loop qRT-PCR验证:提取各样本总RNA等量混合，用含 miRNA特异茎环引物的M-MLV反转录试剂盒(Promega公司)合成cDNA，反应条件为85℃ 5 min、42℃ 60 min、85℃ 10 min。real-time PCR反应采用SYBR green real-time PCR Kit(TOYOBO)在ABI PRISM® 7500 PCR仪上进行。以U6为内参，95℃预反应5 min后，在94℃15 s、60℃ 15 s、72℃ 32 s条件下，运行40个循环，重复3次。检测结果采用2－△△Ct法进行分析。

2 结果

2.1 两样本small RNA数据处理和注释

DS组和对照组分别获得高质量干净序列21 770 729(P)和17 482 100(N)条，主要分布在22 nt长度周围。其中分别有8 087 250(P)和12 536 630(N)条序列与全基因组匹配，分类注释(图1)。两组样本表达miRNA/miRNA*序列共有395种编码于 316个 miRNA基因，其中 DS组miRNA表达序列243种(218种 miRNA和25种miRNA*)，共计2 208 096条(约占 28%);对照组miRNA表达序列349种(295种miRNA和54种miRNA*)，共计6 369 123条(约占51%)。在两组样本中都有表达的miRNA和miRNA*序列分别有178种和19种。

2.2 两样本miRNA表达谱的差异

图1 Small RNA匹配序列在两组样本中所占的比例Fig 1 The percentage of matched small RNA sequence tags in both groups

两组样本显著差异表达的miRNA共有149种(表1)，其中有6种在DS组中表达上调，143种表达下调。此外，有51种miRNA特异性表达于对照组(表2)。21号染色体已注释的14个miRNA基因，除 let-7c、miR-99a、miR-125b 和 miR-155 在 DS组中低表达外，其余10个21号染色体miRNA基因在两组中均未表达。Stem-loop qRT-PCR验证结果见(图2)。

2.3 两样本miRNA的染色体分布

两样本表达miRNA编码基因的染色体分布见(图3)。两样本miRNA基因的表达丰度染色体分布如(图4)。

表1 归一化后表达量大于1000 TPM的差异表达miRNA/miRNA*Table 1 The differentially expressed miRNA/miRNA*with the normalized expression level＞1000 TPM in two groups

表2 51个特异表达于对照组样本的miRNA/miRNA*Table 2 51 miRNA/miRNA*are specially expressed in the control group

3 讨论

miRNA是一种内源性单链非编码RNA，其编码基因主要位于蛋白编码基因的内含子或基因间区，有的miRNA还有其独立的启动子和增强子，可独立完成自身的转录过程，其表达具有时间和组织特异性［6－7］。到目前为止，在 miRNA 数据库 miRBase(release17.0)中已注释人miRNA基因有1 283个，可编码1 733种miRNA/miRNA*成熟序列，其中有14个miRNA编码基因位于21号染色体上。已有研究证明21号染色体上 5种miRNA(let-7c，miR-125b，miR-155，miR-802 和miR-99a)在DS胎儿脑和心脏组织中均高表达，超过1.5倍［8］，在DS患者智力低下、免疫缺陷等临床症状的形成过程中具有重要作用［2］。在本实验中与对照组相比，表达的21号染色体miRNA编码基因除miR-802外，其余4个miRNA 基因(let-7c、miR-125b、miR-155 和 miR-99a)并未出现理论中的1.5倍以上升高，反而表达降低。此种现象也存在于DS患者其他组织细胞关于21号染色体基因差异表达的研究中［9］，说明miRNA基因的表达具有其时间和组织特异性。此外，对miR-802在Illumina测序中未检测到，可能与Illumina测序small RNA建库过程中反转录引物的特异性较低有关，这与文献［8］的芯片研究结果一致。

miRNA对基因表达的调节主要有“基因转录沉默(transcriptional gene silencing，TGS)”和“转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)”两种途径［6］。以往关于DS患者全基因组基因和蛋白表达谱的研究发现大部分基因及蛋白在DS患者中均高表达［3，10］。通过生物信息学和实验研究证明［4］，miRNA与其靶基因的表达之间存在一种负向调控关系，一个miRNA可调控多个mRNA的表达。

图4 两组样本miRNA表达丰度的染色体分布Fig 4 The chromosome distribution of miRNA expression abundance in both groups

在本实验中，大部分miRNA分子在DS患者中均低表达。通过TGS途径，miRNA的低表达可促进其靶基因的表达和翻译，进而提高蛋白表达水平。这在一定程度上解释了为什么DS患者全基因组基因和蛋白表达会升高以及21号3染色体导致2倍染色体基因表达紊乱的原因。通过对两组样本所测miRNA基因及其表达丰度的染色体分布研究，发现表达miRNA编码基因在两样本染色体上的分布趋于一致，但其表达丰度在染色体上的分布却明显不同:DS组主要分布于8、16、17和21号染色体，而对照组主要分布于3、8、14、16、17和22号染色体。提示这些2倍染色体基因编码的miRNA可能在DS患者各有害临床性状的形成过程中具有重要作用。

综上，本实验通过Illumina深度测序技术对DS胎儿全基因组miRNA表达谱和染色体分布特征的研究，初步探讨了miRNA与DS全基因组基因表达紊乱之间的关系;差异显著和特异表达的miRNA分子可作为DS胎儿潜在的产前筛查诊断指标。但关于miRNA、基因和蛋白之间在DS患者中的相互作用调控网络以及与DS患者有害临床性状的关系还有待进一步的研究。

［1］Sommer CA，Henrique-Silva F．Trisomy 21 and Down syndrome:a short review［J］．Braz J Biol，2008，68:447 －452．

［2］Elton TS，Sansom SE，Martin MM．Trisomy-21 gene dosage over-expression of miRNAs results in the haploinsufficiency of specific target proteins［J］．RNA Biol，2010，7:540 －547．

［3］Patterson D．Molecular genetic analysis of Down syndrome［J］．Human Genetics，2009，126:195 －214．

［4］ Satoh JI，Tabunoki H．Comprehensive analysis of human microRNA target networks［J］．BioData Min，2011，4:17－26．

［5］Audic S，Claverie JM．The significance of digital gene expression profiles［J］．Genome Res，1997，7:986 －995．

［6］Rearick D，Prakash A，McSweeny A，et al．Critical association of ncRNA with introns［J］．Nucleic Acids Res，2011，39:2357－2366．

［7］Siomi H，Siomi MC．Posttranscriptional regulation of microRNA biogenesis in animals［J］．Mol Cell，2010，38:323－332．

［8］Kuhn DE，Nuovo GJ，Martin MM，et al．Human chromosome 21-derived miRNAs are overexpressed in down syndrome brains and hearts［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，370:473－477．

［9］Sommer CA，Pavarino-Bertelli EC，Goloni-Bertollo EM，et al．Identif;%96%94ication of dysregulated genes in lymphocytes from children with Down syndrome［J］．Genome，2008，51:19－29．

［10］Wang TH，Chao AS，Chen JK，et al．Network analyses of differentially expressed proteins in amniotic fluid supernatant associated with abnormal human karyotypes［J］．Fertil Steril，2009，92:96 －107．