赵文勇，万立华*，粟永萍，冉新泽

(1.重庆医科大学法医学教研室，重庆400016;2.第三军医大学全军复合伤研究所，重庆400038)

研究发现，神经干细胞体外能分化为神经元，移植于受损的神经内可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩［1－2］，然而足量的神经干细胞获得途径相对有限且扩增较困难，寻找新的移植细胞极为重要［3］。新近研究发现，间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cell，MPC)可体外诱导分化为神经元样细胞［4］，且具有易获取、易生长、增殖能力强等特点，可望成为神经干细胞的替代种子细胞［5］。既然MPC体外诱导可以分化为神经元样细胞，那么将其移植于神经离断处能否延缓失神经肌肉萎缩呢?目前鲜见报道。基于此本研究进行了相关探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

GFP转基因C57小鼠6只，雌性，清洁级，3周龄，体质量(10±1)g;C57小鼠36只，雄性，清洁级，12周龄，体质量(20±1)g;由中国人民解放军第三军医大学动物中心提供。动物使用许可证:SCXK(渝)2007-0004;环境许可证:XYXK(渝)2007-0004。

1.2 主要试剂

兔抗鼠 α-actin、MHC、GAPDH抗体及羊抗兔IgG/TRITC二抗(Sigma公司);蛋白提取液(Pierce公司);RNAiso Reagent、RNA PCR Kit(AMV)ver.3.0(TaKaRa公司);肌细胞生成素扩增引物为5'-TGG AGCTGTATGAGACATCCC-3'，5'-TGGACAATGCTCAG GGGTCCC-3'，磷酸甘油醛脱氢酶扩增引物为5'-ACC ACAGTCCATGCCATCAC-3'，5'-TCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'，MyoD 扩增引物为:5'-GCCCGCGCTCCA ACTGCTCTGAT-3'，5'-TCTTTTGGGCGTGAAGAACCA G-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 MPC的分离、培养及鉴定

取GFP转基因C57小鼠后肢长骨，MPC的分离、培养及鉴定方法参见文献［4］。

1.4 小鼠腓肠肌失神经支配模型的制备

C57小鼠随机分为MPC移植组、神经断离组及对照组，每组12只。小鼠腓肠肌失神经支配模型制备方法参照文献［6］;对照组不作任何处理。术后2和4周，每组随即取6只小鼠断颈处死并提取双侧小腿腓肠肌作实验观察。

1.5 MPC体内移植

选取第3代MPC用PBS调整细胞浓度至5×105个/μL。5 μL缓慢注于 MPC 移植组神经断离处，神经断离组同法注入等量PBS;对照组不作任何处理。

1.6 观察指标

1.6.1 一般情况:观察小鼠后肢活动能力情况。

1.6.2 MPC移植存活情况:切取MPC注射部位周围肌肉行组织冰冻切片，利用GFP转基因小鼠体细胞自发绿色荧光的特点，荧光显微镜下观察移植细胞存活情况。

1.6.3 腓肠肌湿重维持率测定:完整取下左右侧腓肠肌称重，右侧除以左侧，计算腓肠肌湿重维持率。

1.6.4 肌纤维横截面积维持率的测定:取小鼠双侧后肢腓肠肌中份肌腹行组织冰冻切片，HE染色，采用VDSⅢ型半自动图像分析仪(A．M．S公司)测量肌纤维横截面积(cross section area，CSA)，右侧除以左侧，计算其维持率。

1.6.5 超微结构观察:右后肢腓肠肌中份肌腹切取少量组织进行超薄切片，用JEM-12OOEX透射电镜观察退变的肌细胞核、线粒体、内质网、肌丝肌节的形态及胶原纤维的变化。

1.6.6 Western blot检测 α-actain、MHC 的表达:参照说明书提取肌肉总蛋白质，经过电泳、半干法电转膜及封闭后，兔抗鼠α-actain/MHC、羊抗兔IgG分别与膜37℃温育，间以洗膜，终以化学发光试剂盒显影、定影及摄片，最后在凝胶成像系统下分析处理，灰度扫描进行半定量分析。

1.7 RT-PCR检测Myogenin、MyoD的基因表达

参照说明书提取肌肉总RNA并进行反转录，常规方法进行PCR及凝胶电泳，最后在紫外透射仪下扫描图像，采用Quantity one图像分析软件进行半定量分析。

1.8 统计学分析

采用SPSS10.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 一般情况

随着治疗时间的延长，MPC移植组小鼠右后肢活动能力逐渐接近正常。

2.2 MPC体内移植存活情况

MPC注射部位周围肌肉见发绿色荧光的细胞均匀分布于肌细胞间隙(图1A);神经断离组肌内未见确切发绿色荧光的细胞(图1B)。

2.3 肌肉湿重及横截面积维持率变化

术后2和4周，MPC移植组小鼠腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率均显著高于神经断离组(n=6)(图2)。

2.4 超微结构观察

术后4周，与神经断离组比较，MPC移植组细胞核明显增大、核质染色均匀，异染色质发达;线粒体数量增多，肿胀不明显，线粒体脊较多，形状相对正常;内质网扩张少;肌丝肌节排列整齐，无明显的融合;肌纤维间隙胶原纤维量少 (图3)。

2.5 肌动蛋白和肌球蛋白的表达

术后4周，MPC移植组肌动蛋白、肌球蛋白的表达强度显著高于神经断离组和对照组(n=6)(图4)。

图3 腓肠肌超微结构变化Fig 3 Changes of morphology of gastrocnemius

图4 腓肠肌α-actin、MHC的表达Fig 4 Expression of α-actin，MHC of gastrocnemius

2.6 RT-PCR检测Myogenin、MyoD基因表达

术后4周，MPC移植组MyoD的基因表达强度显著高于神经断离组及对照组，Myogenin基因表达强度显著高于神经断离组;对照组未发现明显Myogenin基因表达(n=6)(图5)。

3 讨论

图5 腓肠肌Myogenin、MHC的表达Fig 5 Expression of Myogenin and MHC of gastrocnemius

由于神经干细胞获得途径有限且扩增困难，寻找新的移植细胞至关重要。尽管间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能、来源广泛、取材方便、危险性低、无免疫排斥反应及体外可定向分化为神经元样细胞［7－9］等特点，然而体外培养小鼠MPC时却极易受到造血干细胞的污染而使增殖效果不理想［10］，其用来肌内移植治疗失神经性骨骼肌萎缩难免受到造血干细胞的干扰。近年来研究发现，MPC同样具有BMSCs的特点，由于其来源于密质骨，体外培养时可避免造血干细胞的污染，不失为神经干细胞的可选种子细胞［11］。那将MPC移植于神经断离处能否定植存活并发挥延缓骨骼肌萎缩的作用呢?

研究发现，随着治疗时间的延长，MPC移植组小鼠右后肢活动能力逐渐恢复正常，移植细胞能够定植存活并均匀分布于肌细胞间隙，肌丝肌节排列整齐且肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的程度明显优于神经断离组，肌肉湿重、肌纤维横截面积维持率的下降幅度及α-actin、MHC的降解速度显著低于神经断离组，这表明MPC神经断离处移植可有效延缓骨骼肌萎缩。

研究表明，MyoD是成肌分化的决定因子，新生和再生的骨骼肌卫星细胞含有高水平的MyoD蛋白，骨骼肌再生时，肌卫星细胞激活早期表达MyoD，随后所有增生肌卫星细胞均表达 MyoD，因此，MyoD被视为肌卫星细胞激活的一个标记蛋白［12］。大量动物实验发现:成体骨骼肌一旦失神经支配，Myogenin表达上调，继而启动一系列骨骼肌特异的胚胎性受体和收缩蛋白的合成，而这些胚胎性蛋白的表达是失神经骨骼肌接受神经再支配的必要前提［13］。本实验研究发现，术后4周，MPC移植组MyoD表达强度显著高于神经断离组及对照组，Myogenin基因表达强度显著高于神经断离组。因此，推测延缓骨骼肌萎缩的可能机制是:定植存活的MPC分泌了某些营养因子，通过轴突运输到达腓肠肌，导致被激活的肌卫星细胞成肌分化产生大量的新生肌纤维抑或直接抑制了肌细胞的萎缩，最终肌肉湿重、肌肉蛋白含量及肌纤维横截面积得以维持，但其具体作用机制有待进一步实验研究。

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