卢 楠，毛 恺，廖鲜艳，翁新楚，宋红生，黄俊逸

（上海大学生命科学学院，上海200444）

自由基衰老学说指出人类衰老主要是由于自由基造成的[1]。D-半乳糖衰老动物模型自1985年提出以来，已应用于模拟自然衰老小鼠或大鼠的脑[2-4]和肝[5-7]氧化损伤模型。D-半乳糖是一种还原性糖，在一定范围内可以被机体代谢。然而，高浓度的D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用下转化成醛糖和过氧化氢物，进而导致氧自由基增多[8]，自由基的氧化积累会损伤细胞内DNA、蛋白质、细胞膜脂质等大分子，致使机体逐渐衰老。此外，D-半乳糖能与氨基酸的氨基反应生成糖基化终产物（AGE），AGE会增加异常的氧化磷酸化，增加氧化应激，而氧化应激的增加将引起线粒体、神经损伤，进一步使得认知能力下降和寿命缩短[9]。抗氧化活性肽是最近被广泛研究的一类天然活性肽，抗氧化活性肽如小麦胚活性肽[10]、花生抗氧化肽[11]、鸡骨胶原蛋白肽[12]等在D-半乳糖衰老动物模型体内都表现出较强的抗氧化活性。研究表明蚕蛹蛋白具有很好的营养价值和生理功效[13]。但是，长期以来，我国的蚕蛹加工利用率极低，除少数经烘干粉碎作为营养添加剂外，多数用作饲料甚至肥料，还有很多被废弃，造成资源的巨大浪费。已有研究通过饲喂幼鼠实验表明蚕蛹多肽具有抗肿瘤[14]，降低血清胆固醇作用和抗氧化作用[15]。通过环磷酰胺造免疫力低下模型表明蚕蛹多肽溶液能提高免疫低下小鼠的免疫器官重量和外周血白细胞数[16]。然而，有关蚕蛹多肽对D-半乳糖衰老小鼠的抗氧化生理功效未见有报道。本实验通过研究经碱性蛋白酶Alcalase 2.4L酶解脱脂蚕蛹制得的蚕蛹多肽对D-半乳糖衰老模型小鼠抗氧化作用，以期为蚕蛹多肽在理论及实践上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干蚕蛹 安徽省霍山县丝绸厂；昆明种小鼠90只，雌雄各半，重量30～32g，1月龄 上海斯莱克实验动物有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L FG（根据SB/T 10317-1999测得酶活为124000U/mL）诺维信（中国）投资有限公司；D-半乳糖（D-gal）中国医药集团上海化学试剂公司；过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、考马斯亮蓝测定蛋白质试剂盒 南京建成生物工程中心；谷胱甘肽（GSH）沃凯有限公司；百福美鱼胶原蛋白粉 海南华研生物科技公司；其他试剂 均为分析纯，国药集团上海化学试剂公司。

MP200B型电子分析天平 上海亿测电子设备有限公司；KX-21N型血常规分析仪 希森美康医用电子有限公司；灌胃针、手术剪、手术镊 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕蛹多肽的制备 干蚕蛹索氏抽提油脂得蚕蛹蛋白（蛋白含量94%），蚕蛹蛋白的酶解条件为底物浓度5%，pH8.30，Alcalase 2.4L碱性蛋白酶加酶量190200U/L，温度50.47℃，时间2.45h，经过甲醛滴定法测得水解度DH为18.5%，冷冻干燥即得蚕蛹多肽。

1.2.2 动物分组及喂养 实验小鼠饲养温度为18～22℃，自然光照，自由采食和饮水。实验前将90只小鼠在实验环境下给予基础饲料饲养至3月龄，按体重随机分成9组，分别是正常对照组（N），模型对照组（Mod），蚕蛹多肽低、中、剂量组（SPP-L、SPP-M、SPP-H），蚕蛹蛋白组（Pro），谷胱甘肽组（GSH），VC组，鱼胶原蛋白组（Fish）。除N组外，其余8组腹腔注射600mg/（kg bw·d）D-半乳糖，同时SPP-L、SPP-M、SPP-H组分别按200、600、1000mg/（kg bw·d）的剂量灌胃蚕蛹多肽，Pro组灌胃930mg/（kg bw·d）剂量的蚕蛹蛋白，GSH组灌胃150mg/（kg bw·d）剂量的GSH，VC组灌胃10mg/（kg bw·d）剂量的VC，Fish组灌胃600mg/（kg bw·d）剂量的鱼胶原蛋白肽。N组注射等体积生理盐水，灌胃等体积的蒸馏水，每隔3d称量一次，调整灌胃量，实验持续42d。

1.2.3 抗氧化指标的测定 实验末日禁食12h后摘眼球采血，颈椎脱臼处死，称取0.1～0.2g脑组织和肝脏，加入9倍体积的生理盐水，于匀浆器中制成10%的组织匀浆液，3000r/min离心10min，取上清液备用。脑组织与肝组织中T-AOC、CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量的测定采用试剂盒进行测定。

1.2.4 免疫能力的测定 将待测各组小鼠脱颈椎处死，称体重，解剖去胸腺及脾脏，用电子天秤杆精密称取湿重，计算胸腺指数和脾指数。小鼠胸腺或脾指数=胸腺或脾重量（mg）/体重（g）。小鼠摘眼球取血约1mL，置于含EDTAK2、EDTAK3抗凝剂的血常规管中，血液分析仪检测小鼠WBC数目。

1.2.5 统计学处理 数据采用平均数X±标准偏差SD（±SD）以及百分数表示，各组数据均数间用t检验判断其差异显著性。p＜0.05为显著性差异，p＜0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 SPP对衰老小鼠脑组织和肝组织中CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA含量的影响

由表1和表2可知，与实验组比较，Mod组脑和肝组织中MDA含量的升高和CAT、SOD、GSH-Px、TAOC活力的降低均呈极显著（p＜0.01）。而SPP各组脑和肝组织中CAT、SOD、GSH-Px、T-AOC活力与Mod相比均有不同程度地提高，SPP-H组提高显著（p＜0.01或p＜0.05）。同时脑组织MDA分别从Mod组13.36nmol/mg prot降为SPP-L、SPP-M、SPP-H组13.33、12.65、10.47nmol/mg prot，肝组织中MDA分别从Mod组9.98nmol/mg prot降为SPP-L、SPP-M、SPP-H组9.75、8.64、8.15nmol/mg prot。

其中与衰老模型组相比，SPP-H组显著降低MDA含量，显著提高CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC活力（p＜0.01或p＜0.05），表明SPP对动物体内脂质过氧化终产物的生成有较强抑制作用，可能是由于SPP中疏水性氨基酸可使抗氧化肽与脂肪酸之间的相互作用增强，提高其对自由基的捕捉能力[17]，或者SPP中存在螯合催化脂质链式反应的金属离子，从而能够较强地抑制机体内的脂质过氧化，在一定程度上延缓衰老，起到抗氧化的功效[18]。SPP的抗氧化结果与文献报道的小麦胚活性肽[10]与乳清蛋白肽[11]对D-gal致衰老小鼠的影响效果一致。

阳性对照Pro组以酶解得到SPP-M组相同剂量灌胃，与Mod组比较，Pro组能略微提高CAT、SOD和TAOC含量，说明SPP具有比蚕蛹蛋白更高的抗氧化活性，因为蛋白通过水解才能释放出一些活性肽类，抗氧化肽的抗氧化性与肽中含有的某些可与自由基反应的特殊基团有关，即供氢基团，只有当这些肽在适当分子量时，这些特殊的供氢基团才能得到最大的暴露而与自由基充分作用，表现出较强的抗氧化活性[19]。VC和GSH都是市场上常用的抗氧化保健物质，阳性对照VC和GSH组以与SPP-M组相同体外还原力的剂量灌胃，结果表明SPP组的抗氧化效果与GSH和VC相当。鱼胶原蛋白肽是近年市场热销的抗氧化产品，通过水解深海鱼类胶原蛋白得到纯度较高分子量较小的抗氧化肽，具有延缓皮肤衰老、增强记忆力等功效[20]。阳性对照Fish组以与SPP-M组相同剂量灌胃，结果表明，SPP-M、SPP-H组的抗氧化作用高于Fish组。

表1 小鼠脑组织抗氧化能力（X±S）Table 1 The antioxidation function of brain（±S）

表1 小鼠脑组织抗氧化能力（X±S）Table 1 The antioxidation function of brain（±S）

注：#：表示与N组相比较，p<0.05；##：表示与N组相比较，p<0.01；*：表示与Mod组相比较，p<0.05；**表示与Mod组相比较，p<0.01；n=10；表2～表3同。

组别 MDA（nmol/mg prot） CAT（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH-Px（U）T-AOC（U/mg prot）N组 8.92±1.31 16.43±2.19 153.32±7.31 84.56±7.76 3.31±0.48 Mod组 13.36±2.14## 12.64±1.14## 130.44±10.51## 71.07±7.48## 2.01±0.24##SPP-L组 13.33±2.34 12.13±1.19 127.75±7.29 74.55±7.82* 2.19±1.26 SPP-M组 12.65±3.46 15.67±0.51** 134.41±13.77* 81.43±4.95** 2.31±0.44 SPP-H组 10.47±1.65** 15.99±1.29** 148.65±16.74** 77.38±6.72** 2.98±0.72**Pro组 12.63±3.13 12.36±1.11 129.77±14.69 74.57±6.43* 2.41±0.55 GSH组 10.77±2.22** 16.08±2.75** 144.53±9.27** 78.64±4.63** 2.71±0.40*VC组 11.64±3.15* 16.05±1.56** 145.36±16.49** 74.53±7.67* 2.58±0.62 Fish组 12.06±2.58 14.73±2.40** 130.28±14.64 75.28±8.83** 2.67±0.74

表2 小鼠肝脏抗氧化能力（X±S）Table 2 The antioxidation function of liver（±S）

表2 小鼠肝脏抗氧化能力（X±S）Table 2 The antioxidation function of liver（±S）

组别 MDA（nmol/mg prot） CAT（U/mg prot）SOD（U/mg prot）GSH-Px（U）T-AOC（U/mg prot）N组 7.58±1.10 112.38±8.41 111.28±7.41 92.25±8.57 3.04±0.68 Mod组 9.98±2.05## 64.46±6.61## 82.46±14.12## 80.50±6.44## 1.70±0.74##SPP-L组 9.75±1.06 89.41±9.79* 100.31±5.46* 80.31±7.44 2.54±0.65 SPP-M组 8.64±1.15* 96.36±7.41** 108.38±11.38** 89.32±6.62** 2.51±0.53*SPP-H组 8.15±1.10** 100.94±8.85** 108.54±12.26** 90.28±9.35** 2.60±0.73*Pro组 9.71±0.94 74.51±10.42 90.49±7.47 83.85±7.55* 2.55±0.57*GSH组 8.56±1.12* 101.30±13.78** 106.56±21.94** 85.54±6.38** 2.78±0.88*VC组 8.64±0.95* 94.23±2.13* 101.60±14.29* 87.42±9.45** 2.63±0.95*Fish组 8.77±1.07 92.24±3.44* 107.66±14.54** 82.62±7.65 2.61±0.79*

在一定时间内连续给小鼠注射大剂量D-gal后，机体会产生过量的H2O2、·OH和O2－·等自由基，使体内的SOD和GSH-Px等活性降低，从而使机体的抗氧化水平降低，生物膜脂质过氧化，最终引起亚急性衰老，其中脑衰老出现的最早[10]。已有研究表明氧自由基造成神经元坏死从而导致一系列的神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病[21]。而抗氧化剂能通过缓解氧化损伤，提高脑部抗氧化防御体系，从而提高学习记忆能力[22]。肝脏是机体最主要的排毒器官，它具有较高的代谢率，自由基的累积会造成肝损伤，肝脏抗氧化防御体系的完整性对健康非常重要[23]。抗氧化剂能通过抑制caspase-3活性和增强PI3K/Akt通路来减少肝细胞凋亡[6]。结果表明，通过SPP的摄入，衰老小鼠的脑组织与肝脏均不同程度减缓了氧化损伤，并呈一定剂量依赖性，由此可见，SPP是一种良好的抵抗机体衰老的抗氧化活性物。

2.2 SPP对衰老小鼠免疫器官重量和外周血白细胞数（WBC）的影响

脾脏和胸腺是机体两大免疫器官，其在机体的免疫调节和免疫因子分泌上必不可缺。血液白细胞则是机体主要的免疫活性细胞在抵御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要作用。如表3所示，在调节衰老小鼠的免疫器官指数和血液免疫细胞数上，与衰老模型组相比，SPP各组免疫器官指数和WBC均有不同程度地提高，SPP-H组提高极显著（p＜0.01）。与文献中报道的大豆肽对免疫低下小鼠的作用效果一致[24]。对于衰老模型小鼠，小鼠机体调控系统能够积极反应起来，缓解小鼠急剧免疫力低下的异常状况，此时配合SPP的摄入，可以发现SPP可减轻小鼠的免疫机能衰弱现象，特别是SPP-H组提高免疫能力相当于GSH组，显著改善小鼠胸腺和脾脏萎缩以及血液白细胞数减少症，体现出SPP作为提高机体免疫力保健品的开发价值。

表3 小鼠免疫指标（±S）Table 3 The immune function in different groups（S）

表3 小鼠免疫指标（±S）Table 3 The immune function in different groups（S）

外周白细胞数（×109/L）N组 3.08±0.09 2.17±0.14 7.83±0.28 Mod组 2.30±0.13## 1.67±0.13## 6.41±0.18##SPP-L组 2.70±0.12* 1.98±0.24 7.00±0.21*SPP-M组 2.75±0.13* 2.03±0.13 7.02±0.35*SPP-H组 2.79±0.08** 2.24±0.16** 7.20±0.32**Pro组 2.64±0.12 1.96±0.05 6.64±0.23 GSH组 2.88±0.14** 2.08±0.12* 7.12±0.28**VC组 2.77±0.15* 2.05±0.13* 7.00±0.19**Fish组 2.62±0.17 2.06±0.14* 6.93±0.16*组别 脾脏指数（mg/g）胸腺指数（mg/g）

3 结论

灌胃中、高剂量的SPP后，与Mod组相比，小鼠脑组织和肝脏的MDA的含量显著降低（p＜0.05或p＜0.01），而CAT、SOD、GSH-Px和T-AOC显著提高（p＜0.05或p＜0.01）。因而SPP能提高衰老小鼠的抗氧化水平，并呈一定的剂量相关性。

SPP-M、SPP-H组在调节衰老小鼠的免疫器官指数和血液免疫细胞数上效果显著（p＜0.05或p＜0.01）。对于衰老模型小鼠，小鼠机体调控系统能够积极反应起来，缓解小鼠的免疫机能衰弱状况。

与阳性对照蚕蛹蛋白组和鱼胶原蛋白肽组相比，SPP表现更强的减缓小鼠衰老的作用，SPP-H组对小鼠抗衰老作用相当于等体外抗氧化效果的谷胱甘肽组，体现出SPP作为抗氧化保健品的开发价值。

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