李昌灵，杨海麟，李宇佶，张 玲，王 武，*

（1.江南大学教育部工业微生物技术重点实验室，江苏无锡214122；2.怀化学院生命科学系，湖南怀化418008）

普通小球藻属绿藻门（Chlorophyta），小球藻属（Chlorolla），是一类普生性单细胞微藻[1]。小球藻广泛分布于淡水和海水中，除利用光能和无机碳（如，CO2和碳酸盐等）进行光合自养以外，还可利用一种或多种有机物作为能源和碳源在黑暗中生长[2]，即进行异养发酵。小球藻富含油脂、蛋白质、碳水化合物、维生素、食用纤维、微量元素和其他生物活性物质[3]，具有降血压、降血脂，抗动脉粥样硬化，增强免疫力，抗肿瘤以及抗病毒感染等保健功能[4]。海水的盐度约在35，但是近海的淡水稀释或蒸发等导致海水的盐度发生变化（盐度范围在10～70）[5]。盐度变化引起的渗透压对海藻产生氧化胁迫[6]。大量研究表明：在生长和光合作用过程中，大型藻类会对其产生影响的单个或多环境因素（如，温度，光照、pH、营养及盐度）协同作用产生生理响应[7-11]。海洋植物对不利的过多活性氧（如，过氧化氢、单态氧、超氧自由基和羟基等）能快速做出响应，并在细胞内产生一些物质进行中和[12]，并且为了适应渗透压胁迫产生一些生理反应，如产生一些抗氧化和生理调节物质（包括可溶性蛋白、脯氨酸、脂质和脂肪酸等），通过这些生理功能和相应的行为来调节对细胞产生毒害的渗透压，离子失衡和氧化作用[12-15]。低渗或高渗均能影响细胞外部的电势和细胞内的膨压、离子分布和有机质的溶解度，过高或过低的渗透压会影响细胞的分裂和生长[16]。通过增加细胞膜上脂肪酸饱和度可产生更致密的脂质双分子层以减少小分子渗透[6]。盐度同样能对单细胞海藻产生胁迫作用[17-18]，如：破坏光合色素，阻碍氮磷等营养的利用，抑制藻细胞的分裂与生长导致细胞氧化而死亡等，影响小球藻工业化生产。本研究主要研究发酵过程中盐度对小球藻细胞生长、蛋白质、部分氨基酸以及油脂合成的影响，以探索通过改变盐浓度调控小球藻胞内组分的实现手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小球藻藻株Chlorella vugaris C9-JN2010 本实验室从海水中分离并经过人工选育获得，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心（菌种保藏登记号为CCTCC M 2010373）；种子培养基 BG11培养基[19]（单位mg/L），NaNO31500，MgSO4·7H2O 75，CaCl2·2H2O 36，柠檬酸6，Na2EDTA 1，柠檬酸铁铵 6，Na2CO320，K2HPO440；微量元素（A5）：ZnSO4·7H2O 0.222，CuSO4·7H2O 0.079，MnCl2·4H2O 1.81，Na2MoO4·2H2O 39，Co（NO3）2·6H2O 0.049，H3BO32.86；发酵培养基修改BG11培养基：NaNO3和K2HPO4分别为350.0和25.0mg/L，其余成分不变；Nile red Sigma-Aldrich公司；过硫酸钾 爱建德固赛（上海）引发剂有限公司；其余分析用药品为分析纯 上海国药集团。

YXQ-LS-50S1型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZHWY200B型摇床上海智城分析仪器制造有限公司；DHP-2000型电热恒温培养箱 天津市华北实验有限公司；水平层流净化工作台 苏州洁净技术研究所；分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；F-4600型荧光分光光度计、U3900型紫外分光光度计 日立公司；Digestion Unit K-424、Digestion Unit K-35 瑞士BUCHI公司；Digital BuretteⅢ 德国普兰德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养 挑取固体平板上培养的藻株至含有1mL dd H2O的2mL离心管中，混合物用枪头吹打均匀。分别取适量接种于含有50mL BG11液体培养基的100mL三角瓶中，置于恒温光照摇床中振荡培养，培养条件为：光照周期为16h：8h，温度为25℃，pH 7.0，通气流量为0.1vvm，光照强度4000lux的培养条件下培养4d。

1.2.2 盐度实验 以标准BG11培养基培养处于对数生长期的小球藻种子液，分别接种于NaCl浓度为0%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%装有400mL培养基的500mL反应瓶中，调整初始pH为7.0，初始接种浓度为吸光值0.5±0.05（D680nm），折合干重约（0.150 ±0.015）g/L，于温度为（25±1）℃，光强为4000lux，光暗周期为16h：8h条件下，连续通气（气流量为0.1vvm，由底部通入）培养6d。

1.2.3 生物量和生长速率测定 培养至一定浓度后取样，用灭菌双蒸水进行10倍浓度梯度稀释，用紫外-可见分光光度仪测定680nm波长处各稀释样品的吸光值，同时取各稀释样品于8000r/min离心10min后，洗涤并将沉淀藻体在80℃恒温干燥至恒重后测定藻体干重，并制作标准曲线。培养期间每12h取样一次，用紫外-可见分光光度仪测定680nm波长处的吸光值，并建立回归方程见式1，根据式1计算藻生物量；平均比生长速率见式2。

其中：X1是第一次取样时（t1）的生物量，X2是第二次取样时（t2）的生物量。

1.2.4 总氮及总磷检测 小球藻培养液于10000r/min离心5min后，收集上清液用于总氮（TN）及总磷（TP）含量测定。总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法（GB 11894-89，水质总氮的测定）；总磷采用过硫酸钾氧化-钼酸铵分光光度法测定（GB 11893-89，水质总磷的测定）。

1.2.5 生理参数的检测 叶绿素含量的检测以95%的乙醇提取采用分光光度法检测[20]。蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法[21]，蛋白质含量（mg/L）=氮含量（mg/L）×6.38。游离脯氨酸测定参照文献[22]的方法。油脂含量采用修改的Nile red法[23]，油脂含量（μg/mL）=0.496X+0.178（R2=0.991）。

1.2.6 数据分析方法 数据采用软件origin进行统计分析，每个实验重复3次，实验所得值为平均值±标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 盐度对小球藻的生长的影响

小球藻培养在不同NaCl浓度培养基中，NaCl浓度对其生长产生影响，结果见图1、图2。小球藻C9-JN2010在淡水中生长最佳，其生物量、平均比生长速率及生产效率均最高，分别为0.750g·L-1、0.225d-1和0.125g·L-1·d-1。根据图1可知，小球藻在0～96h生长速度较慢；在96～144h进入对数期生长较快。由图2可知，随着盐浓度升高，盐对生长的抑制越显著。当盐浓度在0%～2.5%，小球藻可较好地生长，而盐浓度达到5.5%或以上，藻细胞生长几乎停止而死亡。盐度导致植物细胞生长受抑或死亡的主要原因有细胞外部环境的渗透压过大，导致细胞大量失水及干扰细胞膜上的电荷及pH等[6，16]。另外，由于渗透压的胁迫，引起细胞内产生过多的活性氧化物对细胞产生毒害作用，也可导致细胞死亡[17-18]。

图1 不同NaCl浓度下小球藻的生长曲线Fig.1 The growth curves of Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

图2 不同NaCl浓度下小球藻生物量和平均比生长速率Fig.2 Productivity and mean specific growth rate of Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

2.2 藻细胞中光合色素的变化

培养在不同NaCl浓度的小球藻C9-JN2010，藻细胞内光合色素发生变化（图3）。在0%～1.5%盐浓度范围内，光合色素的含量随着藻细胞生长增加，至96h达到最高值，分别为39.50、32.80mg·g-1。随后，色素含量开始下降。当盐度为2.5%，培养至48h光合色素含量与24h相比稍微降低，96h又上升至19.30mg·g-1，与刚开始接种细胞相当，随后又开始降低。这可能是因为藻细胞在前对盐度有一定的适应期，并对产生的胁迫进行响应。而在3.5%～5.5%NaCl浓度，随着藻细胞的生长，光合色素含量在不断的降低，至96h已达到最低分别为4.10、2.30、1.10mg·g-1。总之，随着盐浓度的升高，小球藻细胞内光合色素含量不断降低，这与Singh等[24]报道的结果一致。Lu等[25]认为由于光合系统PⅡ对NaCl敏感，导致氧的释放及二氧化碳固定受抑制，且光合色素对盐度的敏感比对细胞生长更强。另外，光合色素的合成需要大量的氮，若氮经过叶绿体光呼吸电子传递链进行利用受阻，导致藻细胞对氮的利用受抑制影响细胞的分裂与生长[17]。

图3 NaCl浓度对小球藻胞内光合色素含量的影响Fig.3 Content of chlorophyll in the algal cell cultivated in different concentration of NaCl

2.3 盐度影响小球藻对N、P的利用效率

图4 不同NaCl浓度下小球藻对氮磷的利用效果Fig.4 Results of consumption of nitrogen and phosphorus by Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

培养在不同NaCl浓度的小球藻C9-JN2010，在停留时间为144h内，随着生长的进行，对氮磷的消耗在不断增加，见图4a、4c。小球藻在前96h，由于生长速度较慢，对氮磷的利用速度也较慢。而在96～144h藻细胞增长速度加快，其氮磷的消耗也加快。由图4b和图4d可知，在无NaCl条件下，小球藻对氮磷的消耗效果最好，培养至144h，培养基中的氮磷浓度分别为3.00、0.23mg·L-1，其氮磷利用率分别为96.4%、93.5%，消耗强度分别达到9.10、0.71mg·L-1·d-1。随着NaCl浓度的增加，小球藻的生长受到不同程度的抑制，导致氮磷的利用效率降低。尤其在5.5%NaCl浓度时，藻细胞对氮磷的利用效率很低，培养基中残留的氮磷浓度很高，分别为53.80、4.30mg·L-1，其氮磷利用率仅为3.9%、4.4%；其消耗强度分别0.50、0.04mg·L-1·d-1。这是因为光合色素受到破坏，细胞生长受到抑制，导致其对氮磷等营养的摄取受阻。

2.4 盐度对蛋白质及游离脯氨酸含量的影响

小球藻C9-JN2010培养在不同NaCl浓度，停留时间为144h，考察NaCl浓度对蛋白和游离脯氨酸合成的影响（图5、图6）。由图5可知，培养至144h，高盐度影响藻细胞的蛋白合成，低NaCl浓度藻细胞的蛋白含量高，而随着盐浓度增加藻细胞的蛋白含量相应降低。在无盐培养基中藻蛋白含量最高为55.0%（W），细胞蛋白质生产效率为68.40mg·L-1·d-1，而在5.5%NaCl中蛋白含量最低仅为37.4%，蛋白质生产效率为13.80mg·L-1·d-1。本研究发现藻在低盐度培养蛋白含量高，与Richmond等[26-27]报道的结果一致。

盐度同样影响细胞内氨基酸的合成，尤其对游离脯氨酸的影响非常显著，见图6。在无盐（0%）和高盐浓度（3.5%～5.5%）下，脯氨酸随着藻细胞生长而增长较慢，在48h脯氨酸含量达到最高值，且均较低，约为0.10%～0.17%。在无NaCl时，脯氨酸含量最低仅为0.1%左右。而在1.5%和2.5%NaCl浓度时，脯氨酸随着藻细胞生长而增长较快，分别在48、96h达到最高，为1.55%（W）、2.25%（W），随后开始下降。主要原因可能是藻细胞适应了低盐度环境后，以脯氨酸作为氮源和能源物质加以利用而继续生长，导致细胞内其含量在后期开始下降。脯氨酸含量最高与最低之比超过20.0倍。有关盐度对小球藻中脯氨酸含量的影响报道较少，为目前报道的最高比值。该藻在2.5%NaCl浓度时脯氨酸积累最多，盐度过高或过低都影响脯氨酸的积累。Gzik[28]利用不同浓度NaCl处理甜菜发现叶子中脯氨酸含量在4.0mol/L NaCl浓度最高，且是对照的12.0倍左右。盐胁迫小球藻通过Glu途径积累脯氨酸的含量除取决于活性上升外，Kalinina等证实盐胁迫下海水小球藻胞内脯氨酸迅速积累还与光呼吸乙醇酸途径的激活和Glu脱氢酶的活化有关。曾有报道，许多植物在盐胁迫下，细胞内脯氨酸大量积累。其除作为细胞质内渗透调节物质外，在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒和能量库调节细胞氧化还原势等起重要作用[29]。Kiyosue等[30]研究了盐胁迫下的拟南芥叶和根中脯氨酸合成关键酶基因，发现P5CR基因的转录的mRNA提高了5.0倍和2.0倍，P5CS基因mRNA水平提高十倍以上。关于微生物的盐胁迫下胞内脯氨酸积累的报道较少。另有报道，高盐处理某些耐盐藻类并没有明显提高胞内脯氨酸含量[31]。可能这些耐盐藻以其他的生理物质来调节渗透压。也有研究发现，在低盐和高盐条件下Ulva pertusa和G.tenuistipitata均能大量积累脯氨酸[32-33]。可能不同藻种具有不同生理特性，对抗盐胁迫所需的生理物质不同而导致了此种差异。

图5 不同NaCl浓度处理小球藻C9-JN2010细胞的蛋白含量及生产效率Fig.5 Content and productivity of protein from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

图6 不同NaCl浓度处理的小球藻C9-JN2010细胞脯氨酸含量Fig.6 Content of proline from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

2.5 盐度对油脂含量的影响

图7 小球藻C9-JN2010在不同NaCl浓度处理的细胞油脂含量Fig.7 Content of lipid from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

小球藻C9-JN2010培养在不同NaCl浓度，停留时间为144h，发现NaCl浓度对油脂合成有显著影响（图7）。在0.0%～2.5%NaCl浓度，随着盐浓度的升高，藻细胞内油脂含量明显上升（4.2%～15.5%），且在2.5%NaCl浓度时，油脂含量最高达到15.5%（W），其生产效率为16.10mg·L-1·d-1。而当NaCl浓度超过2.5%时，藻细胞内油脂含量则随着盐浓度的升高不断降低。在未添加NaCl的培养基中，藻细胞内油脂含量最低仅为4.2%（W），其生产效率也最低为3.33mg·L-1·d-1（图7）。藻细胞油脂最高与最低值之比约3.6。适当增加盐度有利于藻油脂的积累[34-35]，本研究也支持其观点。Harwatia等[36]报道0.0%～2.0%盐度处理热带淡水藻Chlorococcum sp.，在2.0%盐浓度处理下油脂含量最高，其油脂含量的最高与最低值之比约为3.0。盐处理植物能诱导细胞内总油脂的显著增加[37]。

3 结论

在未加NaCl的培养基中小球藻C9-JN2010生长最佳，生物量、光合色素含量、比生长速率和生产效率均达最大为0.75g·L-1、39.50mg·g-1、0.225d-1和0.125g·L-1·d-1。藻蛋白含量最高为55.0%（W），其生产效率为68.40mg·L-1·d-1，且小球藻对氮磷的利用效率也高至96.4%及93.5%，其利用强度分别为9.10mg·L-1·d-1和0.71mg·L-1·d-1。

当藻细胞培养在2.5%NaCl浓度下，在96h脯氨酸含量达最高为2.25%（W），其最高（在2.5%NaCl）与最低值（在0.0%NaCl）之比约20.0倍。脯氨酸是该小球藻对盐胁迫的重要调节物质。有关Chlorella vulgaris细胞中游离脯氨酸对盐浓度的响应机理有待进一步研究。藻细胞内油脂含量在144h达最高为15.5%（W），其生产效率为16.10mg·L-1·d-1，油脂含量的最高与最低值之比约为3.6。

在耐盐植物中，细胞内积累甘油酯往往与盐度胁迫耐受力有关[38]。本研究表明，以获取微藻蛋白质为目的，可通过低盐度培养；以获取脯氨酸为目的，则可提高盐浓度至适中，大幅度提高胞内游离脯氨酸含量；5.0%盐浓度下，则能提高微藻油脂含量甚至脂肪酸组成比例。发酵培养过程中可通过改变盐浓度调控微藻生理代谢支流，以达到增强胞内主要营养组分合成的目的。

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