李 艺，孟 镇，钟其顶，仇 凯，熊正河，*，栾同青，3，张泽生

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.中国食品发酵工业研究院，北京100027；3.山东轻工业学院，山东济南250353）

抗生素使用不当已成为引起肠道菌群失调的最常见诱因[1]，抗生素在抑制或杀死致病菌的同时，也常同时损伤正常菌群，造成不同程度的菌群失调。近年来，越来越多的研究表明，益生菌产品能有效预防和治疗抗生素引起的菌群失调。植物乳杆菌作为益生菌中重要的一个成员其调节肠道菌群失调的作用已经被证明，并广泛用于乳品、药品及果蔬类产品的发酵[2-3]。

植物乳杆菌对肠道菌群作用效应本质上为肠道微生态区系的变化。立足于微生态学观点，研究植物乳杆菌对肠道菌群的调节及肠道菌群的演替，对植物乳杆菌功能的研究具有重要的意义。肠道微生物生态系统十分复杂，肠道中绝大多数微生物的生长需要厌氧环境，而目前的厌氧培养技术不足以观察肠道菌群的多态性及动态变化。随着分子生物学技术的发展，为研究动物肠道微生态提供了简便而快捷的方法[4-5]。其中DGGE技术近年来逐渐被应用于检测动物胃肠道主要细菌类群的多态性[6-9]，从而更加全面准确地反映复杂肠道微生物菌群结构多样性。

目前，关于植物乳杆菌对肠道菌群失调作用的评价仍然很大程度上依赖选择性培养方式[10-11]，并且大多数研究比较集中于益生菌的作用效果上[10-12]。而有关益生菌调节过程中肠道菌群的整体变化的研究鲜有报道，这些信息的缺失使菌群整体性变化的研究无法展开，成为揭示肠道菌群演替与各种病理状态关系的瓶颈。本研究利用DGGE技术研究植物乳杆菌对抗生素相关性肠道菌群失调的调整过程，研究抗生素、植物乳杆菌与肠道菌群变化的关系，并对头孢地尼的耐药菌株及抗生素相关性腹泻的致病菌进行初步研究。为进一步研究益生菌作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌 昂立公司；昆明小鼠，雌性，体重（18±2）g 军事医学科学院实验动物中心；乳杆菌选择性培养基（MRS）、伊红美蓝培养基（EMB）、肠球菌琼脂、脑心浸液琼脂（BHI）北京陆桥技术有限公司；引物F338GC/R518、F338/R518、M13F/M13R、dNTPs、X-gal、IPTG 上海生工生物工程技术服务有限公司；TransTaqTM HiFi DNA Polymerase、DNA纯化试剂盒、pEASY-T3 Cloning Kit、Trans1-T1 北京全式金生物科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、SDS 北京全新拓达科技有限公司；去离子甲酰胺、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 Sigma公司。

恒温生化培养箱 上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机 Sigma公司；梯度PCR仪 Biometra公司；水平电泳仪 北京六一仪器厂；凝胶成像仪 Vilber lourmat公司；变性梯度凝胶电泳仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及菌群失调模型的建立 小鼠20只，静养1d适应环境后，按体重随机分为两组，即正常对照组、植物乳杆菌治疗组，每组各10只，单独喂养。正常对照组灌胃生理盐水；植物乳杆菌治疗组灌50mg/mL头孢地尼水溶液0.2mL/次，每天2次，时间间隔6h，连续5d后，收集粪便做肠道菌群分析。之后，植物乳杆菌治疗组灌胃植物乳杆菌溶液（109CFU/mL），连续5d，每天收集粪便样品。

1.2.2 小鼠粪便活菌计数 无菌称取小鼠粪便，经10倍倍比稀释后，选择合适浓度在选择性培养基上培养计数，每个浓度重复3次。以下培养基用于活菌计数检测：BHI Agar用于厌氧总菌培养；MRS用于乳杆菌的选择培养；BSM由MRS添加0.05%（w/v）盐酸半胱氨酸及0.05%（w/v）莫匹罗星后制得，用于双歧杆菌的选择培养；肠球菌琼脂培养基用于肠球菌培养；EMB培养基用于兼性厌氧肠杆菌培养。BHI平板、MRS平板及BSM平板置于37℃厌氧条件下培养48h后计数；肠球菌琼脂平板、EMB平板置于37℃有氧条件下培养24h后计数，数据以CFU/g表示。

1.2.3 小鼠粪便DNA的提取及PCR扩增 粪便菌群总DNA的提取方法参见文献[13]。提取的DNA通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其DNA完整性。以16S rDNA可变区V3区为靶标，进行PCR扩增，上游引物：F338-GC：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，下划线部分为GC夹；下游引物R518：5’-ATTAC CGCGGCTGCTGG-3’PCR反应体系为：总反应体积为50μL，其中包括10×Buffer（Mg2+）5μL，10mmol/L dNTP混合液1μL，10mmol/L引物各1μL，模板1μL，Taq酶0.3μL，加双蒸水ddH2O至50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸7min。PCR扩增产物5μL加3μL的溴酚蓝，混匀，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，恒压80V 1h，EB染色15min，在紫外凝胶成像系统下成像，保存图谱。

1.2.4 DGGE电泳及染色 参照Muyzer等[14]方法，对16S rDNA V3可变区序列的扩增产物进行DGGE分析。DGGE使用8%聚丙烯酰胺凝胶，将100%变性梯度定义为含40%（v/v）甲酰胺和7mol/L尿素，变性梯度为30%～60%，电泳条件如下：60℃20V电压下预电泳30min，随后在60V的固定电压下电泳16h。电泳结束后，进行EB染色。DGGE凝胶切胶并采用Qantity One（Bio-Rad）进行相似性和多样性分析。

1.2.5 数据统计 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，实验数据用均数±标准差（x±s）表示，不同实验组之间的差异分析采用Student—t检验，p＜0.05为差异有显著性统计学意义，p＜0.01为差异有极显著性统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 粪便活菌计数

昆明雌性小鼠经头孢地尼灌胃处理5d后，乳杆菌和厌氧总菌明显减少，而且未检测到双歧杆菌、肠球菌和肠杆菌，说明造模成功，如表1所示。

表1 小鼠粪便菌群检测结果比较（lg CFU/g标本，均值±SD）Table 1 The comparison of fecal microflora detection result（lg CFU/g sample,mean±SD）

2.2 靶标16S DNA的V3区通用引物PCR-DGGE分析

小鼠粪便细菌的16S rDNA V3区的DGGE图谱及聚类分析见图1。图1中不同位置的条带代表不同的优势细菌，亮度反映出细菌相对量的多少。抗生素灌胃前的正常小鼠有大量条带存在，说明正常的肠道存在大量的细菌，用其制备动物模型，对肠道菌群进行相关研究具备可行性。抗生素连续处理5d后DGGE图谱显示条带数量显著减少，说明长时间大量抗生素处理能够杀灭肠道中的大部分细菌。

图1 小鼠粪便细菌微生物区系16S rDNA V3区引物的DGGE图谱Fig.1 DGGE profiles obtained with universal primers V3 of 16S rDNA of fecal microbiota

图2 UPGMA相似性聚类分析Fig.2 UPGMA cluster analysis for similarity coefficients

DGGE图谱中条带的差别可以很好地反映出实验过程中小鼠肠道细菌组成的差异与相同之处。本实验中灌胃抗生素后（泳道2）的B、I条带是特有条带；植物乳杆菌治疗组泳道A、D、G条带，是灌胃植物乳杆菌后特有条带。条带L存在于各组的样品中，为共有条带，说明这个条带所代表的细菌，可能对头孢地尼具有一定的耐药性。从DGGE图谱整体可见，随着植物乳杆菌灌胃时间的延长，条带数目逐渐增多，说明肠道菌群的多样性增加。在植物乳杆菌处理第4d肠道菌群结构与正常小鼠基本一致。虽然灌胃植物乳杆菌可以使肠道菌群有所恢复，但与正常组小鼠的肠道菌群相比有些菌仍然无法恢复，如条带K。泳道2中的条带B是抗生素组中的优势条带，其在灌胃益生菌初期存在，至灌胃第3d消失，该条带所对应的菌有可能是对肠道不利的菌，随着灌胃时间延长，植物乳杆菌对该菌有抑制作用。由此可见，DGGE指纹图谱带型的差异，能很好地反映出抗生素与植物乳杆菌对小鼠肠道菌群的不同影响。

平均数进行非权重配对法（UPGMA）相似性聚类结果如图2所示，更进一步证明了植物乳杆菌作用过程中DGGE图谱的异同。结果显示，灌胃植物乳杆菌过程第2d与第3d相似性系数77%；第4d与第5d相似性为86%；灌胃植物乳杆菌过程中各泳道聚为一族，与正常小鼠相比相似性为60%。

植物乳杆菌对肠道微生物菌群多样性的分析见表2。头孢地尼处理后条带数明显减少，即肠道菌群种类减少，经结合细菌数量的多样性指数分析，菌群多样性减少。植物乳杆菌治疗组与抗生素处理组相比，条带数有所增加，但与小鼠灌胃前比较，条带数和菌群多样性仍存在差异，但考虑细菌数量的多样性指数与灌胃前无显著性差异，说明植物乳杆菌可以有效调节肠道菌群紊乱。

2.3 DGGE图谱对应的肠道优势条带DNA序列分析

表2 V3区引物DGGE图谱的多样性指数分析Table 2 Diversity indices analysis of the DGGE patterns generated from V3 regions

表3 DGGE代表条带序列比对结果Table 3 Tentative identification of DGGE bands by sequencing the excised and Blast analysis

经测序后，用Blast工具与GenBank数据库中已有序列进行比对，结果如表3所示。粪便中的细菌与数据库中的已知细菌序列有很高的相似性，都在99%以上。L条带在实验过程中一直存在，说明该条带所对应的菌对头孢地尼有耐药性，而与L条带同源性最高的是Clostridium clostridioforme（艰难梭菌）是梭菌属的一种专性厌氧菌，一般寄生在人的肠道内。艰难梭菌的菌群生长速度加快，影响肠道中其他细菌，引发炎症。图1中可以看出，在灌胃植物乳杆菌过程中，A条带亮度是逐渐降低的，说明艰难梭菌随着灌胃植物乳杆菌时间的延长其在肠道中的数量逐渐减少。

I条带是灌胃抗生素后特有的条带，与I条带同源性最高的是Pseudomonas stutzeri（施氏假单胞菌），假单胞菌一般能天然抵抗多种抗菌药物，并且本菌在使用抗菌药物治疗过程中易诱导产生耐药性。因此，该菌在灌胃大量抗生素后仍然存在肠道中。

C、M条带是在灌胃植物乳杆菌过程中一直存在的条带，说明这两个条带对应的细菌较容易恢复。与C条带同源性最高的是Bacteroides stercoris（粪便拟杆菌），粪便菌群中的Bacteroides stercoris和结肠癌的高发病风险有显著相关性。由此可知该菌在肠道菌群中占有重要地位。与M条带同源性最高的是Ruminococcus gauvreauii strain，该菌群为专性厌氧菌，是肠道中优势菌群。杨会玲等[15]研究合生素对肉仔鸡肠道微生物区系的影响中也检测到了Ruminococcus gauvreauii strain。

D条带是在灌胃植物乳杆菌前两天很明显，随后条带亮度逐渐减弱。条带D与Bacteroides acidifaciens strain相似性为100%，该菌代表生酸拟杆菌，李永洙[16]研究显示不良鸡群样本中均检测到Bacteroides属的生酸拟杆菌（Bacteroides acidifaciens），该菌对机体生长发育不利。由此可见，植物乳杆菌对肠道菌群有很好的调节作用，抑制有害菌的生长。

F条带是在灌胃植物乳杆菌后亮度逐渐增加的条带，与F条带同源性最高的是Bacteroides uniformis strain（单形拟杆菌），Queipo-Ortuño MI等[17]研究红酒多酚对人类肠道菌群的影响时发现连续四周每天摄入红酒多酚后，Bacteroides uniformis strain数量明显增加。

G条带是正常小鼠没有而灌胃植物乳杆菌的小鼠出现的特有条带，说明该菌在肠道中较难恢复；与G条带同源性最高的是Bacteroides graminisolvens strain。K条带在灌胃结束后仍然无法恢复的特征条带，与K条带同源性最高的Bacteroides caccae strain（粪拟杆菌）。

3 结论

本文采用16S rDNA PCR-DGGE基因指纹分析技术，针对抗生素处理和植物乳杆菌治疗过程中肠道菌群组成变化进行初步分析，探讨植物乳杆菌对抗生素诱导的小鼠肠道菌群失调的影响。实验结果表明：大剂量头孢地尼处理会导致小鼠肠道菌群发生紊乱，对头孢地尼敏感的可培养厌氧总菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌及肠杆菌数量下降99%以上，多样性和定植抗力严重受损，说明本研究肠道菌群失调动物模型制备是有效的。而DGGE图谱显示，Mycoplasma sualvi strain、Clostridium proteolyticum strain两株菌在抗生素处理结束后演替为优势菌群，说明这两株菌是抗生素头孢地尼的耐受菌及抗生素相关性菌群失调所导致临床症状的致病菌。

随着植物乳杆菌饲喂时间的延长，小鼠肠道菌群丰富度呈现逐渐增加的演替过程，至饲喂第4d肠道菌群多样性与正常小鼠基本一致。对图谱上独有的和各组共有的条带进行测序，测序结果表明植物乳杆菌调节小鼠肠道菌群失调的作用主要表现在两个方面：选择性地增加有益菌如Bacteroides stercoris、Bacteroides uniformis strain等的量；抑制致病菌如Clostridium clostridioforme、Pseudomonas stutzeri等的生长。本研究为深入益生菌产品的开发以及进一步探讨益生菌对肠道菌群的作用机制的研究提供了参考。

[1]余贺.医学微生物学 [M].北京：人民卫生出版社，1983：191-195.

[2]Ohland C L，Machaughton W K.Probiotic bacteria and intestinalepithelialbarrrier function [J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010，298：807-819.

[3]刘燕姿.乳酸菌的生理功能特性及应用的研究 [D].秦皇岛：燕山大学，2010.

[4]Hooper L V，Wong M H，Thelin A，et al.Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine[J].Science，2001，291：881-884.

[5]Zoetendal E G，Collier C T，Kolke S，et al.Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota：A Review[J].J Nutr，2004，134：465-472.

[6]冯薇，王加启，刘开朗，等.运用PCR-DGGE分析比较瘤胃中不同饲料固相粘附微生物区系 [J].畜牧兽医学报，2010，41（12）：1556-1562.

[7]张慧玲，韩冰，贺三纲，等.用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响 [J].新疆农业大学学报，2010，33（6）：469-474.

[8]吴高锋.应用PCR-DGGE技术对不同日龄仔猪肠道菌群分布规律的研究[D].郑州：河南农业大学，2009.

[9]温若竹，江芸，刘泽兴，等.甘露寡糖对肉仔鸡肠道微生物区系发育的影响[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2011，37（1）：83-90.

[10]徐致远，郭本恒，王荫榆，等.植物乳杆菌ST-Ⅲ对小鼠肠道菌群的调节[J].中国乳品工业，2006，34（2）：10-12.

[11]曾东，唐雨蕊，倪学勤，等.植物乳杆菌F22对肝脏和肠道微生物菌群的影响研究[J].营养学报，2010，32（4）：370-374.

[12]谢彩虹，袁静，王瑞君，等.嗜酸乳杆菌对抗生素诱导小鼠肠道菌群失调的作用[J].肠外与肠内营养，2006，14（3）：132-136.

[13]Lamontagne M G，Michel F C，Holden P A，et al.Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis[J].Journal of Microbiology Methods，2002，49（3）：255-264.

[14]Muyzer G，de Waale C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbialpopulationsby denaturing gradientgel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction·amplified genes coding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol，1993，59：695-700.

[15]杨会玲，高玉鹏，周利勇，等.合生素对肉仔鸡肠道微生物区系的影响[J].中国农业科学，2011，44（23）：4882-4891.

[16]李永洙.利用PCR-DGGE方法分析不同鸡群的盲肠微生物菌群结构变化.生态学报，2011，31（21）：6513-6521.

[17]Queipo-Ortuño MI，Boto-Ordóñez M，Murri M，et al.Influence of red wine polyphenols and ethanol on the gut microbiota ecology and biochemical biomarkers[J].Am J Clin Nutr，2012，95（6）：1323-1334.