王立霞

（陕西学前师范学院，陕西西安710100）

环磷酸腺苷（Adenosine 3’，5’-cyclic monophosphate，简称cAMP，结构见图1）普遍存在于哺乳动物体内，控制并调节细胞新陈代谢[1-3]，1957年由Sutherland发现。医学研究证实至少40多种疾病（癌症、高血压、冠心病、心源性休克和心肌梗赛等重大疾病）与cAMP代谢有关，cAMP是枣中重要活性物质。据报道，枣成熟果肉中cAMP含量为一般动植物数千至数万倍，具重要开发价值[4-7]。我国枣面积已达150万公顷，产量200万t，新疆和田地区凭借其独特资源优势，近年枣业发展迅速，面积达30多万公顷[8]。本文作者已对不同产地、不同含水量、不同组织骏枣、灰枣中cAMP含量进行研究，并得出结果和田玉枣（山西省交城县骏枣引种于和田后其商品名称为和田玉枣）中cAMP含量相对最高。关于cAMP的提取方法，以往多用传统溶剂法，本研究引入了超声波辅助法，并对这两种方法进行对比，以获取超声波辅助提取和田玉枣cAMP的最优工艺参数。本研究成果为和田玉枣及其他枣品种cAMP深入研究及其开发利用提供参考及理论依据。

图1 环磷酸腺苷结构图Fig.1 Structural of the cAMP

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣 新疆和田玉枣，系2012年10月中旬采摘后烘干的干枣，和田玉枣去核后经40℃干燥，粉碎过60目筛，室温下密封保存，待用；cAMP标准品（纯度≥99%）色谱纯，德国Sigma公司；甲醇（纯度为99.8%）色谱纯，加拿大Promptar公司生产；其余试剂 均为分析纯。

1525型高效液相色谱仪 美国Waters公司；TDL-5型低速大容量离心机 上海安亭科学仪器有限公司生产；UV2550型紫外可见分光光度计 日本Shimadzu公司；JY98-3D型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱检测条件 色谱柱：Brava-BDS C18（250mm×4.6mm，5μm）柱；流动相：甲醇∶pH为3的双蒸水（10∶90，V/V）；流速0.8mL/min；经紫外全波长扫描确定检测波长为257.0nm；温度为室温；进样量20μL[8-11]。

1.2.2 cAMP标准品溶液的制备及标准曲线的制作精密称取cAMP标品2.5mg，置50mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，得0.05mg/L cAMP标品溶液。分别精密吸取标品溶液1、2、3、4、5、6、7、8mL于10mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，得5、10、15、20、25、30、35、40μg/mL的系列标准品溶液，分别精密吸取20μL系列标品溶液注入色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，以cAMP峰面积为纵坐标进行线性回归，得线性方程Y=21592x-4372.7（r=0.9999）[8-10]。

1.2.3 乙醇体积分数对红枣cAMP提取量的影响实验 准确称取和田玉枣粉2g，室温下，分别以液料比15∶1用浓度为5%、15%、25%、35%、45%、55%乙醇溶解，每个水平重复3次。采用传统溶剂浸提法提取，分别在40℃水浴中加热10h，所得溶液离心、过滤、真空浓缩后用双蒸水定容，过0.45μm滤膜，进样分析，依保留时间法对待分析组分进行定性，以峰面积外标法定量[8-9]。测定不同体积分数乙醇中提取物的提取量（μg/g·dw（干重））。

1.2.4 超声波提取条件对红枣cAMP提取量的影响实验 经文献[12-15]研究可知，影响超声波辅助提取效果的主要因素有超声波提取功率、提取温度、提取时间及液料比，因此先对以上4因素进行单因素实验分析，得出较理想的因素水平，然后再通过正交实验设计，确定最佳提取工艺参数[6-12]。除超声波辅助提取功率单因素实验外，在进行超声波辅助法提取其他单因素实验的同时，与传统溶剂法浸提实验进行对比。

1.2.4.1 超声波功率对红枣cAMP提取量的影响实验准确称取和田玉枣粉2g，室温下，以液料比15∶1加入15%乙醇溶液中，提取温度40℃，分别在200、300、400、500、600、700W的功率下超声30min，每个水平重复3次。分别测定提取物的提取量（μg/g·dw），确定最佳提取功率。

1.2.4.2 提取时间对红枣cAMP提取量的影响实验准确称取和田玉枣粉2g，以液料比15∶1加入15%乙醇溶液中，固定超声波提取温度40℃，提取功率为400W，提取时间分别为 10、30、50、70、90、110min，每个水平重复3次。分别测定提取物的提取量（μg/g·dw），确定最佳提取时间。

1.2.4.3 提取温度对红枣cAMP提取量的影响实验准确称取和田玉枣粉2g，以液料比15∶1加入15%乙醇溶液中，固定超声波提取功率为400W，提取时间为50min，提取温度分别为25、35、45、55、65、75℃，每个水平重复3次。分别测定提取物的提取量（μg/g·dw），确定最佳提取温度。

1.2.4.4 液料比对红枣cAMP提取量的影响实验 准确称取和田玉枣粉2g，分别以液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1加入15%乙醇溶液中，固定超声波提取功率为400W，提取时间为50min，提取温度为35℃，每个水平重复3次。分别测定提取物的提取量（μg/g·dw），确定最佳液料比。

1.2.4.5 正交实验 在单因素实验基础上对超声波提取温度、提取时间、液料比、超声波功率采用L9（34）正交实验进行优选，以确定最佳提取条件，因素水平设计见表1。

表1 L9（34）实验因素水平表Table 1 L9（34）Orthogonal factor level table

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对红枣cAMP提取量的影响

乙醇体积分数对红枣cAMP提取量的影响见图2。图2表明，随着乙醇体积分数的增加，cAMP的提取量呈先增大加后缓慢减小趋势。在乙醇体积分数为15%时，cAMP提取量达到最高，为542.33μg/g·dw，考虑能量节省及减少污染等因素，乙醇体积分数以15%为宜。

图2 乙醇体积分数对cAMP提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extracting content of cAMP

2.2 超声波提取条件对红枣cAMP提取量的影响

2.2.1 超声波功率对红枣cAMP提取量的影响 超声波功率对红枣cAMP提取量的影响见图3。图3表明，当超声波功率在200～400W时，cAMP提取量随超声波功率的增大而迅速增加，在功率为400～700W时，cAMP提取量分别为553.56、554.57、555.69、555.80μg/g·dw，提取量增加非常平缓。考虑到功率过大可能会影响物质结构，并加重设备负担，因此选择超声波提取功率为400W。

图3 超声波提取功率对cAMP提取量的影响Fig.3 Effect of power of ultrasonic wave on extracting content of cAMP

2.2.2 提取时间对红枣cAMP提取量的影响 提取时间对红枣cAMP提取量的影响见图4。图4表明，同等条件下，超声波辅助提取法较传统溶剂法提取效率高，优势明显。当提取时间为10～50min时，两种方法cAMP提取量均呈增加趋势，提取时间为50min时，超声波提取法提取量为559.92μg/g·dw；当提取时间超过50min时，超声波提取法cAMP提取量趋于平衡，考虑到时间过长会耗能及对仪器造成不良影响，故选择超声波辅助提取时间为50min。

图4 提取时间对cAMP提取量的影响Fig.4 Effect of extracting time on extracting content of cAMP

2.2.3 提取温度对红枣cAMP提取量的影响 提取温度对红枣cAMP提取量的影响见图5。图5表明，同等条件下，超声波辅助提取法较传统溶剂法提取效率高，优势明显。在超声波辅助提取法中，cAMP提取量随提取温度的升高呈先增加后减少趋势，当提取温度为35℃时，提取量最高，为678.58μg/g·dw，故选择超声波辅助提取温度为35℃。

图5 提取温度对cAMP提取量的影响Fig.5 Effect of extracting temperature on extracting content of cAMP

2.2.4 液料比对红枣cAMP提取量的影响 液料比对红枣cAMP提取量的影响见图6。图6表明，同等条件下，超声波辅助提取法较传统溶剂法提取效率高，优势明显。当液料比低于25∶1时，cAMP提取量随液料比的增加而快速增大，当液料比为25∶1时，cAMP提取量为689.87μg/g·dw；高于25∶1时，cAMP的提取量趋于平衡。综上分析，超声波辅助提取样品中cAMP的液料比以25∶1为宜。

图6 液料比对cAMP提取量的影响Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on extracting content of cAMP

2.2.5 正交实验按L9（34）进行正交实验，结果及数据处理见表2。由极差分析可知，各因素对cAMP提取量影响程度的大小顺序为：提取温度＞液料比＞提取时间＞超声波功率。和田玉枣中cAMP的最优提取工艺为A2B2C1D2，提取温度35℃、提取时间50min、液料比20∶1、超声波功率400W。

表2 正交实验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 两种提取方法比较Table 3 Comparison of different extraction methods

2.3 提取方法比较

采用传统溶剂法[9]提取和田玉枣cAMP，并与2.2.5中得出的超声波辅助提取法最优工艺条件下的结果进行对比。两种方法的工艺条件及实验结果见表3。表3显示，超声波辅助提取法提取效果明显优于传统溶剂提取法。

3 结论

本研究通过单因素和正交实验分析，确定了超声波辅助提取和田玉枣cAMP的最优工艺条件为：乙醇体积分数15%，提取温度35℃、提取时间50min、液料比20∶1、超声波功率400W。在此工艺条件下，和田玉枣cAMP平均提取量为771.95μg/g·dw；影响和田玉枣cAMP提取量的各因素的显著顺序为：提取温度＞液料比＞提取时间＞超声波功率。

通过对两种提取方法的比较，得知超声波辅助法与传统溶剂浸提法相比，具有提取速度快，提取量高，提取温度低等明显优势。

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