王臣东，刘文明，王 婷，田继霞，李彩霞，焦 扬

(河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000)

葡萄酒生产过程中会产生大量的副产物如葡萄籽、葡萄皮。目前，对葡萄籽成分的开发利用主要为葡萄籽油、多酚类物质，而对葡萄籽蛋白质的利用极少。葡萄籽中含有11%～13%的蛋白质。与蛋白质相比，活性肽不仅有比蛋白质更好的消化吸收性能，还具有多种生理功能，如:抗氧化、降血压、调节血脂水平、提高免疫力、促进矿物质的运输和吸收等［1-2］。目前，生产多肽的方法主要有酸解法［3］、酶解法［4］、生物发酵法［5］。与酶解法相比，发酵法的优势是能将微生物产酶和酶水解两步合一，省去酶的分离和提纯步骤，减少生产工艺，降低成本。葡萄籽中含有大量多酚类物质，且多酚类物质易与蛋白质发生结合沉淀。本文以经碱液浸泡脱酚处理后的葡萄籽为原料，采用产胞外碱性蛋白酶的菌株地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)培养发酵，比较了不同处理方式对脱酚葡萄籽粉发酵液多酚和多肽量的影响，并考察了发酵液对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基的清除效果。以期为葡萄籽蛋白的利用提供理论依据，进一步为葡萄籽的综合利用开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄籽 由甘肃张掖国风葡萄酒业有限公司提供;地衣芽孢杆菌30203(bacillus licheniformis) 购于甘肃省微生物保藏中心;斜面培养基 LB 固体培养基;种子培养基 蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.5%，葡萄糖1.0%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%;产酶培养基 酵母浸粉0.2%，糊精0.6%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钙0.06%，干酪素0.2% 所用药品均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄籽粉处理方式

1.2.1.1 萄萄籽脱酚方法 参照文献［6］，将葡萄籽从酿酒后葡萄皮渣中分离，用0.05mol/L NaOH 固液比1∶10 浸泡，80℃水浴浸泡30min，重复三次，清水冲洗葡萄籽，干燥，粉碎过40 目筛，即得到脱酚葡萄籽粉。采用凯氏定氮法测得总蛋白含量12.65%，65℃恒重法测得水分含量10.5%。

1.2.1.2 地衣芽孢杆菌培养方法 将斜面保存的地衣芽孢杆菌转接在平板上，培养24h 后，将单菌落接入装液量20mL/100mL 的种子培养液中，于32℃，150r/min，振荡培养14～16h，使菌浓OD600达到1.2～1.5 之间。将种子液以10% 接种量接入装液量60mL/250mL 的产酶培养基中，于34℃，150r/min，振荡培养8h，得地衣芽孢杆菌和碱性蛋白酶(酶量为180～210U/mL)混合液。

1.2.1.3 葡萄籽粉液制备方法 将地衣芽孢杆菌和碱性蛋白酶混合液以50%的比例加入固液比1 ∶12的葡萄籽粉液中，于34℃，150r/min，振荡培养，得到葡萄籽粉发酵液。以葡萄籽粉液不接菌仅加入等量灭菌蒸馏水为参比Ⅰ，葡萄籽粉液接入等量种子菌液为参比Ⅱ，葡萄籽粉液加入等量的灭菌产酶培养液为参比Ⅲ。

1.2.2 多酚测定方法 采用Folin-Ciocalteu 比色法［7］测定提取液中的多酚含量。

1.2.3 多肽含量测定

1.2.3.1 标准曲线的制作 参考文献［8］，用5%的TCA 配制0.3mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准溶液，分别取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 加蒸馏水至6.0mL，然后加入4.0mL 双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，于2000r/min 离心10min，取上清液测定A540值。以多肽的含量为纵坐标C(mg)，A 值为横坐标，制作标准曲线，得回归方程:

1.2.3.2 样品中多肽含量测定 取2.0mL 葡萄籽粉液，加入2.0mL 10%(W/V)的TCA 水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，取上清液3.0mL，加入双缩脲试剂2.0mL，于漩涡混合仪上混合后，2000r/min 离心10min，取上清液于540nm 下测定OD 值，对照标准曲线回归方程，求得样品溶液中多肽含量C(mg)。

一次浇筑实际体积相对较大，而断面却很小，底板厚度可达95cm，两侧厚度也超过200cm，为局部大体积混凝土，为避免卡开裂，应做好温度控制。在施工过程中，应密切留意入模温度与浇筑速度，在必要的情况下采用掺加冰块的方法进行降温。在完成浇筑后，应及时进行覆盖与洒水养护。

1.2.4 抗氧化活性测定

1.2.4.1 对羟自由基(·OH)的清除率 利用H2O2与FeSO4混合产生·OH，在体系内加入水杨酸能有效地捕捉·OH 并产生有色物质，该物质在波长510nm 处有最大吸收［9］。

在10mL 的试管中依次加2mL 6mmol/L 硫酸亚铁溶液，2mL 6mmol/L 水杨酸溶液和2mL 葡萄籽粉液，混合均匀后，加2mL 6mmol/L 双氧水溶液启动反应，于37℃恒温反应30min，以蒸馏水为参比，考虑到样品本身的吸光值，不加显色剂双氧水得到本底吸光值。对羟自由基(·OH)的清除效率可根据下式进行计算:

式中:A0-为未加发酵液的空白对照值，Ai-加发酵液的测定值，Aj-为本底吸收值。

1.2.4.2 对超氧阴离子的清除率 采用了邻苯三酚自氧化法［10］。取4.5mL pH8 的2.5mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，1.0mL 葡萄籽粉液，2.4mL 蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/L 的邻苯三酚0.1mL，迅速摇匀后倒入比色杯，于325nm 下每隔30s 测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。计算抑制率。

式中:ΔA0为邻苯三酚的自氧化的速率;ΔAi为加入样液溶液后邻苯三酚自氧化的速率。

1.2.4.3 对DPPH 自由基的清除率 参照文献［11］稍作修改，将0.1mL 葡萄籽粉液于0.4mL 100mmol/L Tris- HCl(pH8.2)混匀后，加入2.0mL 0.2mmol/L DPPH 乙醇溶液，摇匀，在暗处放置30min，测定517nm 波长处的吸光度Ai，以2.0mL70%乙醇为参比的本底吸光值，空白对照组以2.0mL 无水乙醇代替样品。DPPH 自由基清除率按以下公式计算。

式中:A0-为空白对照吸光值，Ai-为样液的吸光值，AJ-为参比的本底吸光值。

1.2.5 数据处理 每个处理做3 次重复，以平均值±标准偏差反映各指标的大小。Origin Lab7.5 软件进行数据作图。

2 结果与讨论

2.1 处理方式对脱酚葡萄籽粉液多肽含量的影响

地衣芽孢杆菌属(B.licheniformis)微生物是目前工业用于发酵生产碱性蛋白酶的主要菌种。多数微生物所产碱性蛋白酶，具有水解蛋白脂键、酰胺键和转脂及转肽的能力。在大豆蛋白加工业中，用碱性蛋白酶改性大豆蛋白，可以提高其保健功能。实验用地衣芽孢杆菌30203 菌株所产蛋白酶为胞外酶。采用先培养地衣芽孢杆菌使其菌体繁殖和产碱性蛋白酶达一定程度后，加入一定固液比的脱酚葡萄籽粉，考察发酵时间和不同处理方式下发酵液中多肽变化。结果如图1 所示。

由图1 可见，随时间变化，未接入菌液的参比Ⅰ和参比Ⅲ多肽含量的变化不明显，基本在1.19 ～1.42g/L。参比Ⅱ在前24h 内多肽含量和参比Ⅰ基本持平在1.23g/L 左右，而24h 以后多肽含量明显增加至2.60g/L。对脱酚葡萄籽发酵液而言，时间对其多肽含量影响较明显。在24h 内发酵液多肽含量即达到2.35g/L 左右，随时间延长多肽含量增大，在72h即达到最大值4.23g/L，之后多肽量基本保持不变。由此可见，未接入菌液的参比Ⅰ和参比Ⅲ处理方式下，多肽含量较低，接菌处理后可以明显提高多肽含量，并以先培养菌株使其繁殖和产碱性蛋白酶达到一定程度后，加入一定固液比的脱酚葡萄籽粉的处理方式下得到多肽的量最大。

图1 处理方式对脱酚葡萄籽粉液中多肽浓度的影响Fig.1 The influence of processing mode on peptides concentration of grape seed powder removed phenolic solution

2.2 处理方式对葡萄籽粉液多酚含量的影响

对一定固液比的脱酚葡萄籽，设置不同处理方式的pH 为8.0。考察了不同处理方式下多酚的变化。结果如图2 所示。

图2 处理方式对脱酚葡萄籽粉液中多酚浓度的影响Fig.2 The influence of processing mode on polyphenol concentration of grape seed powder removed phenolic fluid

由图2 可见，参比Ⅰ和参比Ⅲ的多酚含量相当，在60mg/L 左右，且随时间延长多酚含量有降低趋势。参比Ⅱ和发酵液的多酚含量，随发酵时间延长，多酚含量先增加后又降低，在72h 分别达到最大量80.74、128.83mg/L。由此可见，葡萄籽整粒脱酚磨粉后以碱性条件(pH8.0)处理，还是有一定量的残余多酚类物质，而且通过地衣芽孢杆菌的发酵和碱性蛋白酶的作用，葡萄籽粉组织内的多酚类物质会释放出来，但随时间延长，多酚类物质可能发生了氧化或与蛋白共沉作用而有所降低。

2.3 葡萄籽粉液的抗氧化活性

2.3.1 脱酚葡萄籽粉液对羟自由基的清除作用 ·OH是最活泼的氧自由基，对生物体危害较大，可与活细胞中的任何分子发生反应而对机体造成损伤［12-13］。考察了不同处理方式的葡萄籽粉液对羟自由基的清除作用。结果如图3 所示。

由图3 可见，四种处理方式下脱酚葡萄籽粉液对羟自由基的清除作用差异显著。相对来说发酵液最好，参比Ⅱ次之，而参比Ⅰ最差其清除率在20%左右。且对羟自由基的清除效果的趋势与多肽量变化图1 很相似，但随时间延长，清除率降低。可能的原因有二:其一，碱性蛋白酶作用于脱酚葡萄籽粉后其水解得到的多肽组成可能为多种肽片段，且对羟自由基的清除不呈量效关系［14］。其二，在对羟自由基的清除作用中，多肽和多酚可能相互作用，而减弱了清除效果。结合图1 和图2 可得，在实验的处理方式下，脱酚葡萄籽粉液对羟自由基的清除效果主要由碱性蛋白酶水解得到的多肽类物质起作用，而且可能得到的是不同分子量大小的多肽类物质［5，14］。

图3 脱酚葡萄籽粉液对羟自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect to hydroxy free radical of grape seed powder removed phenolic fluid

2.3.2 脱酚葡萄籽粉液对超氧自由基的清除作用超氧阴离子自由基是生命代谢过程中产生的一种重要的自由基，具有很强的氧化能力。考察了不同处理方式的葡萄籽粉液对超氧阴离子自由基的清除作用。结果如图4 所示。

图4 脱酚葡萄籽粉液对超氧阴离子自由基的清除效果Fig.4 Scavenging effect to superoxide free radicals of grape seed powder removed phenolic fluid

由图4 可见，不同处理方式下脱酚葡萄籽粉液对超氧自由基的清除率的差异不显著，参比Ⅰ和参比Ⅲ的清除率相当，在50%左右，参比Ⅱ对超氧自由基的清除率最大值为57.35%，而脱酚葡萄籽粉发酵液对超氧自由基的清除率最大为72.76%。杨碧霞等［15］研究表明，葡萄籽多肽对羟基自由基和超氧自由基的清除能力差异明显，当蛋白酶酶解后等电点沉淀的多肽浓度达8g/L 时，对两者的清除率分别为93.10%和42.79%。结合图1 可得，碱性蛋白酶水解脱酚葡萄籽粉得到的多肽类物质对超氧自由基的清除作用不明显，而葡萄籽粉液的自身水溶性物质，如水溶性较好的低聚合度的原花青素［16］、白藜芦醇［17］等在清除超氧阴离子自由基方面发挥着主要作用，但碱性蛋白酶和地衣芽孢杆菌对葡萄籽粉的作用使其对超氧自由基的清除效果提高了约20%。

2.3.3 脱酚葡萄籽粉液对DPPH 自由基的清除作用 DPPH·是一种稳定的含氮自由基，当待测物质含有抗氧化物时，抗氧化物提供一个电子与其配对结合，使DPPH·的特征紫色消失，根据褪色程度的大小来评价抗氧化剂的抗氧化性［18］。考察了不同处理方式的葡萄籽粉液对DPPH 自由基的清除作用。结果如图5 所示。

图5 脱酚葡萄籽粉液对DPPH 自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect to DPPH free radicals of grape seed powder removed phenolic fluid

由图5 可见，时间对不同处理方式下脱酚葡萄籽粉液对DPPH 自由基的清除率影响不显著，且每种处理方式下的清除率均很稳定。而且参比Ⅰ对DPPH 自由基的清除效果最差，清除率约为35%左右，参比Ⅲ的清除率约为40%，而参比Ⅱ和发酵液对DPPH 自由基的清除率相对较高分别为61.91% 和85.11%。结合图1、图2 可知，碱性蛋白酶水解葡萄籽粉得到的多肽类物质可能是清除DPPH 自由基的主要物质之一，但脱酚葡萄籽粉水溶性成分以及通过碱性蛋白酶和地衣芽孢杆菌发酵后的非多肽类物质的作用也不能忽视。

3 讨论与结论

孙芸等［16］认为，葡萄籽原花青素对DPPH·的清除作用与聚合度无关，对·OH 和超氧阴离子自由基的清除能力随着聚合度的升高而下降。张玲［19］认为，小麦蛋白的酶解多肽类物质对DPPH·、羟基和超氧阴离子自由基的清除能力随多肽分子量的减小而增加，随多肽浓度的增加而增加，分子量小于3000u 的肽片段抗氧化效果最好。邓成萍［20］等人研究了大豆蛋白酶解产物不同分子量肽段的抗氧化性也得到类似的结论。实验中对发酵液采用凝胶电泳定性测定了多肽类物质的分子量范围，在小于21ku 有多条条带。可推测，本研究脱酚葡萄籽粉发酵液清除自由基的差异与发酵液中肽段的分子量偏大以及脱酚后残余原花青素的聚合度有关。但具体原因还有待于进一步研究。

由此，先培养地衣芽孢杆菌使其繁殖和产碱性蛋白酶达到一定程度后，加入一定固液比的脱酚葡萄籽粉的处理方式，得到多肽量最大为4.23g/L。而且通过地衣芽孢杆菌发酵和碱性蛋白酶的作用，葡萄籽粉组织内的多酚类物质会释放出来，最高可达128.83mg/L，但随时间延长，多酚类物质量有所降低。脱酚葡萄籽粉水解后的多肽类物质对羟自由基和DPPH 自由基的清除起关键作用，而且可能得到的是不同分子量的多肽物质，不同片段的多肽物质对自由基的清除效果不同。脱酚葡萄籽粉中的原花青素以及白藜芦醇等成分在清除超氧阴离子自由基方面发挥主要作用，但碱性蛋白酶和地衣芽孢杆菌对葡萄籽粉的作用使其对超氧阴离子自由基的清除效果提高了约20%。

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