黄琳惠，黄奕江，蔡兴俊，莫儒冰

(海南省人民医院呼吸内科，海南海口570311)

支气管哮喘小鼠外周血CD8+CD28-T细胞群和CD8+CD56+T细胞群作用机制研究

黄琳惠，黄奕江，蔡兴俊，莫儒冰

(海南省人民医院呼吸内科，海南海口570311)

目的研究哮喘小鼠外周血细胞与细胞间的关系及两种细胞群在哮喘中的作用。方法30只BALB/c小鼠随机分为对照组和哮喘组，每组各15只。测定小鼠的气道反应性，对支气管肺泡灌洗液行细胞学分类，观察肺组织的病理变化，流式检测小鼠外周血细胞及细胞的比例，分析哮喘中两种细胞之间的相关性。结果成功建立小鼠哮喘模型。①哮喘组小鼠BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞(%)较对照组明显增高；②哮喘组小鼠外周血细胞及细胞比例均较对照组升高；③细胞与细胞数量上呈正相关(r=0.737，P=0.002)。结论哮喘时外周血细胞和细胞数目异常，两种细胞正相关，可能在哮喘发病中起重要作用。

哮喘小鼠模型；气道反应性；支气管肺泡灌洗液；外周血；细胞

临床研究显示，长期使用皮质激素可能会抑制免疫系统的调节功能，破坏免疫稳定，造成哮喘难治，因此，在哮喘的发病源头或其上游抑制其变态反应或建立调节性T细胞(Regulatory T cell，Tr)的抑制作用可能是治疗哮喘的研究方。哮喘中气道有大量Tr细胞浸润。Tr细胞中主要的细胞表型为，后者能产生各种细胞因子发挥细胞毒效应[3]，并与各种细胞相互作用。本文通过新的方法建立哮喘小鼠模型，研究其外周血T细胞在哮喘发病中的作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物SPF级雌性BALB/c小鼠30只，3～5周龄，体重16～18 g，海南医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂和仪器卵蛋白(OVA)：美国Sigma公司；FITC anti-mouse CD8a,PE anti-mouse CD28，PE anti-mouse CD56a：美国biolegend公司；超声波雾化器：广东粤华牌。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及模型制备30只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为哮喘组(n=15)和对照组(n=15)。哮喘组第0、14天给予小鼠腹腔注射致敏，每只每次给予含Ⅱ级OVA 5 mg及氢氧化铝5 mg的生理盐水混悬液200µl。第21天开始对小鼠给予4%OVA生理盐水雾化液40 ml进行雾化激发，1次/d，每次40 min，连续7 d。对照组第0、14天腹腔注射致敏，每只每次给予含氢氧化铝5 mg的生理盐水混悬液200µl。于第21天开始对小鼠给予生理盐水40 ml进行雾化激发，频次和持续时间同哮喘组。

1.2.2 肺功能检查末次激发48 h后，Buxco小鼠肺功能仪无创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性。

1.2.3 肺泡灌洗液(BALF)细胞计数对小鼠气管插管，PBS灌洗。BALF细胞涂片。固定后染色，连续计数400个细胞并行细胞分类，计算各细胞百分比。

1.2.4 肺组织病理学观察将左肺上叶固定后包埋、切片、HE染色。

1.2.5 流式细胞术检测细胞表面分子采集小鼠外周血，处理后行相应荧光抗体染色，流式检测，设立同型对照。

1.3 统计学方法数据以均数±标准差(x-±s)表示。采用SPSS13.0统计软件分析。相关性检验采用Pearson直线相关性分析；两组间样本均数的比较行t检验。以P＜0.05表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 肺功能检查结果采用无创肺阻抗法，通过小鼠肺功能仪测定小鼠的气道反应性。给予300 μl生理盐水雾化1 min，然后再测定浓度递增的乙酰甲胆碱(Mch；3.12 mg/ml、6.25 mg/ml、12.50 mg/ml、25.00 mg/ml、50.00 mg/ml)雾化激发小鼠气道反应性的变化，每次雾化1 min，记录3 min，见表1。

表1 气道反应性(mg/ml)

表1 气道反应性(mg/ml)

组别对照组哮喘组t值P值生理盐水0.542±0.087 0.573±0.109 0.714 0.484 Mch3.12 0.628±0.073 0.684±0.076 1.678 0.111 Mch 6.25 0.675±0.176 1.260±0.086 9.463 0.000 Mch 12.5 1.085±0.370 2.585±0.423 8.437 0.000 Mch 25.00 1.887±0.491 3.980±1.051 5.705 0.000 Mch 50.00 2.606±0.793 7.895±1.415 10.314 0.000

2.2 BALF细胞总数和分类比较①BALF细胞总数：哮喘组显著高于对照组，两组间差异有统计学意义(P＜0.01)。②BALF嗜酸性粒细胞百分率：哮喘组显著高于对照组，两组间差异有统计学意义(P＜0.01)。③BALF中性粒细胞百分率和淋巴细胞百分率：哮喘组显著高于对照组，两组间差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2。

表2 两组BALF中细胞总数和分类的比较(n=15，%)

表2 两组BALF中细胞总数和分类的比较(n=15，%)

组别对照组哮喘组t值P值例数15 15 Neu 5.67±1.45 30.63±4.88 -11.479 0.000细胞总数(×105/ml) 0.52±0.43 1.72±0.15 -14.152 0.000 Eos 0.72±1.09 27.11±4.06 23.328 0.000 Lym 10.52±3.11 21.48±4.30 5.129 0.000

2.3 肺组织病理学观察结果哮喘组支气管、血管周围、肺泡腔内可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润，气道上皮损伤，杯状细胞肥大增生，气道内黏液栓形成。对照组肺组织气道结构清晰，气道纤毛上皮排列整齐，无明显炎症改变，见图1。

2.4 外周血CD8+CD28-T、CD8+CD56+T细胞流式检测结果哮喘组和对照组CD8+CD28-T细胞分别为(13.65±3.075)%和(10.32±2.318)%，CD8+CD56+T细胞分别为(4.11±1.47)%和(2.59±1.19)%，两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；CD8+CD28-T细胞与CD8+CD56+T细胞存在正相关(r=0.737，P=0.002)，见图2、图3和图4。

图1 病理切片(×200)

图2 外周血T细胞流式检测结果

图3 外周血CD8+CD56+T细胞流式检测结果

图4 CD8+CD28-T细胞与CD8+CD56+T细胞的相关分析

3 讨论

支气管哮喘是T淋巴细胞参与的体液免疫过程，也是T淋巴细胞活化、增殖过强，凋亡减弱的过程。Filaci等[2]发现，CD8+调节T淋巴细胞有三种不同亚群，Ⅰ、Ⅱ型T细胞表型为CD8+CD28-。本研究通过建立哮喘小鼠模型，检测小鼠外周血CD8+CD28-T细胞及CD8+CD56+T细胞的比例，分析两种细胞亚型之间的相关性，探讨CD8+CD28-T细胞和CD8+CD56+T细胞在哮喘发病中的作用。

哮喘是以大量表达CD8+CD56+细胞和CD8+CD28-T细胞为特点[4]，我们的实验也证明了这点。上述两种细胞亚群都存在于健康和哮喘小鼠，但在哮喘小鼠外周血中，CD8+CD28-T细胞及CD8+CD56+T细胞亚型的数量均较对照组明显增加。Chamberlain等[5]发现，CD8+T细胞效应性细胞毒作用主要存在于CD28-细胞群，CD28表达缺失标志着作用上分化成为细胞毒性记忆细胞。其他研究也证明，外周血CD8+CD28-T细胞克隆有着较短的质粒，对凋亡有着更强的抵抗[6]。在哮喘和COPD患者及其他自身免疫异常的慢性炎症，如多发性硬化[7-8]患者外周血都有CD8+CD28-T细胞和穿孔素的表达较健康人的明显增加，CD8+CD28-T细胞即是以大量产生穿孔素、TNF-α、IFN-γ从而在自身免疫疾病中发挥调节作用为特点的细胞群[9]。哮喘加剧期间，炎症的表现更倾向于抗病毒反应，而不是对抗嗜酸性粒细胞为主的免疫应答[10]，提示T细胞在介导哮喘及决定糖皮质激素治疗的有效性方面有着独立作用。

CD8+CD56+细胞是哮喘中另一主要的细胞亚型。它们与CD8+CD28-细胞在哮喘中存在着密切的正相关(r=0.737)。CD56，CD158b等标志是常见自然杀伤(NKT)细胞的受体，Umetsu等[11]证明NKT细胞和T细胞在哮喘中的启动作用及它们在机体中同时对TH2细胞因子、CD8+细胞、NKT细胞进行调控的关键步骤。因此，CD8+CD56+和CD8+CD28-T细胞在哮喘的发病过程中是存在密切联系的，但是要了解这两种细胞在哮喘中的相互作用细节，还需要更进一步的研究。

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[11]Umetsu DT,McIntire JJ,Akbari O,et al.Asthma:an epidemic of dysregulated immunity[J].Nat Immunol,2002,3(8):715-720.

Function and mechanism of CD8+CD28-T cells and CD8+CD28-T cells in peripheral blood of asthmatic mouse model.

HUANG Lin-hui,HUANG Yi-jiang,CAI Xing-jun,MO Ru-bing.Department of Respiratory Medicine,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the relationship betweenT cells in peripheral blood of mice and the function of the two subsets in the development of asthma.MethodsThirty Balb/c mice were randomly divided into two groups:asthma group,control group,with 15 mice in each group.The airway responsiveness were measured,bronchoalveolar lavage cytology was performed and lung tissue sections were prepared for histopathologic examination to evaluate the airway inflammation,examine the fraction ofT cells by flow cytometry and correlation analysis.ResultsThe mouse models established successfully.①The total cell number and the percentages of eosinophils in BALF of the asthmatic group were significantly higher than that in the control group;②The percentages ofT cells in peripheral blood[(13.65±3.075)vs(4.11± 1.47)]in asthmatic group were significantly higher than that in control group[(10.32±2.318)vs(2.59±1.19)].③There was a strong positive correlation betweenT cells(r=0.737,P=0.002).ConclusionThe fractions ofT cells are associated with asthma ongoing closely,and there is a strong positive correlation between these two subsets.

Airway responsiveness;Bronchoalveolar lavage fluid;Peripheral blood;CD56+T cell

R-332

A

1003—6350（2013）18—2658—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.18.1107

2013-05-15)

黄琳惠。E-mail：rochelle-11@163.com