刘文丽，张兰威，* ，John shi，易华西

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;2.加拿大农业部圭尔夫食品研究中心，安大略省圭尔夫N1G5C9)

近年来，随着涉及食品病原菌和腐败菌的食品安全事故频繁爆发，人们越来越关注食品安全问题［1］。利用乳酸菌产生的抗菌物质尤其是细菌素来抑制食品腐败菌和致病菌越来越得到人们的认同，乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中由核糖体产生的多肽。Ⅱa类乳酸菌细菌素是一类乳酸菌产生的具有N端保守序列YGNGVXCXXXXCXV，包括形成二硫键的Cys且对李斯特氏菌具有强烈抗菌活性的非羊毛硫氨酸修饰的热稳定性多肽［2］，与其它细菌素相比，由于Ⅱa类乳酸菌细菌素对食品典型的致病菌李斯特氏菌具有更强的抗菌活性和更好的物理化学性质，因此目前被认为是很有发展前途的细菌素［3－5］。为了能更深入地了解Ⅱa类乳酸菌细菌素，使其更有利于应用于食品工业，深入了解乳酸菌细菌素结构和功能关系是必要的。Ⅱa类乳酸菌细菌素构效关系的研究现在涉及到的主要有细菌素的结构域及结构模型、Ⅱa类乳酸菌细菌素对目标指示菌细胞膜的作用过程、细菌素各结构域与细菌素抗菌活性的关系，下面分别进行陈述。

1 Ⅱa类乳酸菌细菌素的结构域及结构模型

通过对近年来Ⅱa类乳酸菌细菌素构效关系研究的总结［6－9］，预测Ⅱa类乳酸菌细菌素的结构域可能是由N端保守序列YGNGV形成的β转角结构、N端β折叠形成的亲水性N端、中间区域形成的亲水或两亲性α螺旋、C端疏水区域形成的两亲性α螺旋组成［6－9］(如图 1a)，这些结构域连在一起就组成了Ⅱa类乳酸菌细菌素的结构模型。

2 Ⅱa类乳酸菌细菌素对目标指示菌细胞膜的作用过程

Ⅱa类乳酸菌细菌素对目标指示菌细胞膜的作用过程主要分为两步。第一步主要是Ⅱa类乳酸菌细菌素通过静电作用与目标指示菌结合(如图1b)，由于Ⅱa类乳酸菌细菌素的N端β转角结构，使N端保守序列YGNGV很容易暴露并被假想的目标指示菌的细胞膜表面(膜结合受体分子)识别，这将能够使Ⅱa类乳酸菌细菌素在目标膜表面正确的定位(如图1b①)。细菌素正确定位后，Ⅱa类乳酸菌细菌素的β折叠通过静电作用与膜结合受体分子结合，这就使Ⅱa类乳酸菌细菌素的β转角和β折叠都与膜结合受体分子结合(如图1b②)。第二步，如图1C，Ⅱa类乳酸菌细菌素的中间区域的倾斜α螺旋和C端疏水区域两亲性α螺旋通过疏水作用与膜结合受体分子结合，使整个Ⅱa类乳酸菌细菌素都与膜结合受体分子结合(如图1C③)，由于C端疏水性比N端强，因此大多数情况下，Ⅱa类乳酸菌细菌素是通过C端和目标细胞膜的疏水相互作用，而使Ⅱa类乳酸菌细菌素重新定位和插入膜内部，这样两个Ⅱa类乳酸菌细菌素共同作用目标指示菌细胞膜，就使目标指示菌细胞膜内组分被泄露或溢出，从而促成孔洞的形成;极少数情况下，Ⅱa类乳酸菌细菌素的N端在膜结合受体分子的两侧相同的位点共同作用，然后，两侧的C端同时通过疏水作用重新定位和插入目标指示菌细胞膜内，从而同样导致目标指示菌细胞膜内组分被泄露或溢出，形成孔洞(如图1C④)。

3 Ⅱa类乳酸菌细菌素各结构域与抗菌活性的关系

3.1 Ⅱa类乳酸菌细菌素N端保守序列YGNGV与抗菌活性的关系

一种假说认为保守序列YGNGV可能与Ⅱa类细菌素的作用机制的识别步骤有关［10］，与作用的专一性无关［6］，这一假说还没有明确的实验证实，但替换和删除保守序列YGNGV对Ⅱa类细菌素抑制李斯特活性的影响却有确切报道。Fleury Y等［11］为了研究mesentericinY10537N端保守序列与mesentericin Y 10537抗李斯特活性的关系，通过酶水解或固相合成删除N端，结果显示删除N端将导致细菌素降低10000倍的抗李斯特活性。Quadri等［12］对 CarnobacteriumpiscicolaLV17B产 生的Carnobacteriocin B2的48个氨基酸序列的第3、33、34、37、46位的氨基酸替换，将第28位氨基酸删除，研究结果表明对细菌素的氨基酸序列进行较小的变动都会导致细菌素抗菌活性的消失和很大程度的降低，细菌素产量也会受到很大影响，特别是 N端。Miller等［13］通过测定Ⅱa类细菌素pediocin AcH合成和分泌的最小需要，结果表明Ⅱa类细菌素pediocin AcH N端并没有横跨膜结合受体分子，但N端保守序列 Lys+1－Tyr－Tyr－Gly－Asn－Gly－Val+7－对pediocin AcH是非常重要的，因为删除这个序列，pediocin AcH的抗菌活性消失。Jitka Rihakova等［14］利用单个氨基酸替换产生单氨酸替换突变体，并利用合成基因在大肠杆菌中表达，从而产生一个重组的细菌素DvnRV41，这个重组的细菌素在N端区域具有4个额外的氨基酸，原因是利用酶水解并保持原有细菌素DvnV41的抗菌活性，为了了解DvnV41的构效关系，Jitka Rihakova利用单个氨基酸替换保守序列中的氨基酸或者C端的氨基酸，从而产生8株单氨酸替换突变体，来研究Ⅱa类细菌素DvnV41的构效关系，研究结果表明替换保守序列中的氨基酸将降低Divercin V41对李斯特氏菌的抗菌活性。此外，Ⅱa类细菌素除了具有典型的保守序列YGNGV，有的还是 YGNGV和 YGNGL，例如，Tomita H等［15］比较了Enterococcus faecalis YI717产生保守序列为YGNGL的bacteriocin 31与保守序列为YGNGV的其它Ⅱa类细菌素氨基酸序列的相似性进行比较，结果表明Ⅱa类细菌素的N端序列具有高度的相似性，表明N端保守序列对Ⅱa类细菌素的抗菌活性有重 要 影 响。Kanatani K 等［16］对 Lactobacillus acidophilusTK9201产生的细菌素 acidocinA(YGTNGV)的研究结果表明Ⅱa类乳酸菌细菌素的保守序列对细菌素的抗李斯特活性有影响。因此，删除或替换YGNGV保守序列将扰乱β转角结构和N端β折叠结构，最终影响的不仅是抑制李斯特氏菌的活性，还包括对其它目标指示菌的抗菌活性。

3.2 N端亲水β折叠与抗菌活性的关系

N端β折叠结构使Ⅱa类细菌素具有两亲特性，使细菌素和膜表面通过静电作用进行细菌素对膜的识别步骤(如图1b②)。这个假说已经被chen等［3］所证实，他的研究结果表明pediocin PA－1的N端β折叠的亲水片段 Lys－1，Lys－11 and His－12，是用来调节细菌素与目标指示菌细胞膜作用的，而位于pediocinPA－1发夹环的尖端的疏水片段 Val－7，Cys－9和 Cys－14，Val－16 和 Trp－18 主要是用来调节细菌素插入目标指示菌细胞膜的过程。Havarstein，L.S等［17］、Miller，K.W 等［18］和 Quadri，L.E.N 等［12］的研究结果表明，不具有 N端延伸、具有前导肽prebacteriocins或者具有麦芽糖结合蛋白 MBP－pediocin AcH的Ⅱa类细菌素N端部分并没有插入目标菌株细胞膜的磷脂双分子层，且和成熟肽相比，前导肽的活性是非常弱的，可能是因为前导肽干涉了细菌素和膜的结合。这些研究都支持了N端β折叠结构涉及了细菌素和膜表面通过静电作用进行细菌素对膜的识别步骤。Deegan 等［19］和 Kazazic 等［20］也证实了带电荷的亲水N端β折叠结构通过静电作用与目标指示菌细胞膜上的带阴离子磷脂头部的极性残基结合。

3.3 中心区域形成的亲水或两亲倾斜α螺旋与抗菌活性的关系

Ⅱa类细菌素中心区域的倾斜α螺旋主要涉及细菌素对目标膜受体分子的重新定位和插入功能，如图1C③。对于这一假说观点的研究支持，目前报道较少。Bennik等［21］的研究结果表明九个Ⅱa类细菌素都拥有倾斜的α螺旋结构(跨越残基15、16、27、28)，这些螺旋结构能够以40°角插入疏水－亲水表面，因此能够促进细菌素分子插入到目标菌株的细胞质膜;Fimland 等［22］通过结合 pediocin PA－1，sakacin P and curvacin A(sakacin A)的N端部分(残基1－21)和这些细菌素的C端部分构建杂交的Ⅱa类细菌素，分别描述为 Ped－Sak，Sak－Ped，Cur－Sak和Sak－Cur，这些杂交的Ⅱa类细菌素都包含α螺旋区域，但只有Ped－Sak(结合 pediocin PA－1的1－21残基和sakacin P末端的22残基)具有倾斜的α螺旋结构域，因此只有Ped－Sak能够以45°角插入到目标膜的疏水－亲水表面，并且保持了和原始细菌素同样的抗菌活性。

3.4 C端疏水区域形成的两亲性α螺旋与抗菌活性的关系

如图1C③和④，Ⅱa类细菌素的疏水C端和两亲α螺旋参与了细菌素插入目标膜受体分子的磷脂双分子层和导致细胞内容物泄露及溢出的过程［23－24］。与N端不同的是，C端区域包含假定的跨膜螺旋，这些跨膜螺旋使Ⅱa类细菌素的C端区域具有更多的多样性，并且这些细菌素对目标指示菌的专一性有一定作用。Fimland等［22］通过对杂交细菌素 Ped－Sak，Sak－Ped，Cur－Sak 和 Sak－Cur的结构观察表明C端是Ⅱa类细菌素抑制目标指示菌的主要结构域，并且是膜识别的重要结构域。Fimland等［25］对pediocin－PA－1的研究结果证实了 pediocin－PA－1的C端(20－34个残基)是插入目标膜受体分子的决定结构域，对膜识别区域有非常重要的作用，此外，pediocin－PA－1的C端影响 pediocin－PA－1的活性，可能是在目标膜上的疏水区域被占据的结果。Jitka Rihakova等［14］利用单个氨基酸替换产生位点突变菌株，研究了C端区域对Divercin V41抗菌活性的影响，研究结果表明删除C端区域将降低Divercin V41的抗菌活性。Hele'n Sophie Haugen等［26］的研究表明pediocin PA－1 C端螺旋区域片段显示的抗菌活性是pediocin PA－1的一半。Todorov等也指出C端是细菌素区别目标细胞特异性的关键结构域［27］。

4 二硫键与抗菌活性的关系

所有Ⅱa类细菌素都至少包含一个二硫键，二硫键对Ⅱa类细菌素的抗菌活性也可能有一定的影响。赵爱珍等［28］依据Enterocin A的氨基酸序列，设计半胱氨酸替换突变体Enterocin A(C14S)和Enterocin A(C47W)，通过大肠杆菌表达系统获得重组突变体。用还原剂β－巯基乙醇处理MBP－Enterocin A，采用琼脂扩散实验检测重组Enterocin A、突变体及还原产物的抗无害李斯特菌LIN3活性，结果表明:N末端融合部分不含有半胱氨酸的MBP－Enterocin A或His tag－Enterocin A均表现强抗菌活性;而N末端融合部分含有半胱氨酸的GST－Enterocin A，表现很弱的抗菌活性;半胱氨酸替换突变体及MBP－Enterocin A还原产物均不显示抗菌活性。实验结果证明二硫键是Enterocin A抗菌活性的重要影响因素。Clarissa S.Sit等［29］为了探讨 leucocin A的构效关系，在建立leucocin A的3D结构以后，利用化学合成的方法合成了一系列代替第9和第14位残基的结构类似物［26，28］，研究结果表明，二硫键用 C 环替代后将会导致 leucocin A 活性降低10倍。Clarissa S.Sit等［30］揭示了未激活(C9S，C14S)－leucocin A和激活(C9L，C14L)－leucocin A的3D溶液结构，结果表明利用Ser和Leu来替换两个cys残基，并没有影响到抗菌肽的电荷，因此可以说明二硫键并没有干涉到细菌素与目标菌体细胞膜的静电相互作用。

图1 Ⅱa类细菌素的结构模型及对目标细胞膜的假设作用位点［31］Fig.1 Schanatic representation of the structure of a modelⅡa bacteriocin and the predicted location its domains with respect to target cell membrane［31］

5 阳离子氨基酸与抗菌活性的关系

由于含有阳离子氨基酸的Ⅱa类细菌素不能有效地与细胞膜表面结合，从而使Ⅱa类细菌素抗菌活性减弱，研究者们相继证实了这一观点。Miller KW等［2］研究表明在 pediocin AcH中的阳离子氨基酸Lys－1，His－42 and Lys－43 使抗菌活性减少，主要原因是细菌素不能有效地与细胞膜表面结合。相反，Chen等［3］研究表明突变的 pediocin PA－1残基由于缺少带阳离子的Lys－11和 His－12，以至于不能与目标细胞膜结合，从而使抗菌活性消失。此外，还有一种观点认为pediocin PA－1三个His残基的质子化对于目标细胞膜的吸附作用最大，pediocin PA－1的Lys－11对于目标细胞膜孔的形成非常重要。

6 其它氨基酸与抗菌活性的关系

Miller KW等［2］研究结果表明用色氨酸 Trp－18代替pediocin PA－1中的精氨酸Arg会导致两个数量级的抗菌活性损失。对于大多数Ⅱa类细菌素来说，这个位置的Trp是很好的保留残基。相似的，去除N端Trp残基，mesentericin Y105的抗李斯特活性也戏剧性地降低。D J Derksen等［32］利用不相关的氨基酸代替leucocin A 9位和14位的胱氨酸，结果表明替换后的细菌素与leucocin A相比，活性并没有改变，为了解释这一现象D.J.Derksen提出了一种假说认为侧链之间的相互作用可能使第9位和第14位残基之间形成一个环，从而维持细菌素活性的形成［29，33］。

7 结论

目前，Ⅱa类乳酸菌细菌素的构效关系还没有研究透彻，主要停留在报道较多的细菌素上，如pediocin PA－1、Enterocin A 等，对近些年来新分离出的具有较强、广谱抗菌活性的Ⅱa类乳酸菌细菌素构效关系的研究较少。因此，未来的研究如果能扩大研究范围必定会取得突破性成果，也为未来Ⅱa类乳酸菌细菌素的实际应用提供理论依据和指导。另外，利用Ⅱa类乳酸菌细菌素的结构与功能的关系来研究和获得具有抗菌活性强、抗菌谱宽、稳定性高的细菌素或类似物也是一个很好的研究方向。

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