刘爱旗　夏璐

【摘要】 目的：探讨CCK-8法和MTT法检测兔成纤维细胞活性的最佳实验条件，并比较其优略。方法：以传至第3代的兔成纤维细胞为研究对象，分别用CCK-8法和MTT法检测兔成纤维细胞的增殖活性。结果：MTT法的最佳检测波长490 nm，CCK-8法最佳检测波长为450 nm，两法的最佳检测时间均为加入试剂后4 h。适宜检测的细胞数量范围为2×103/ml ～1×105 /ml 个。结论：CCK-8法较MTT法检测的灵敏度高，准确性好，是一种优于MTT法的检测兔成纤维细胞增殖活性的方法。

【关键词】 CCK-8； MTT； 兔成纤维细胞； 细胞增殖

检测细胞增殖活性的方法很多，如3H放射性同位素掺入法、细胞仪法、台盼蓝染色法、MTT法等。其中以MTT法以其快速而简便、不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用，但MTT法形成的Formazan为水不溶性的[1]，加有机溶剂溶解，由于在去上清液时可能会丢失小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了避免Formazan的部分丢失，研究人员又开发了很多水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等[2]，本文对CCK-8法和MTT法检测兔成纤维细胞增殖活性的最佳实验条件进行探讨，并比较其优略。

1 材料与方法

1.1 实验对象 以兔筋膜作为成纤维细胞原代培养组织，培养、传代并培养传至第3代，以第3代的成纤维细胞为研究对象[3]。

1.2 材料与仪器 胎牛血清、胰酶、DMEM、双抗、PBS液。60 mm培养皿、倒置相差显微镜、离心机、96孔板、酶联免疫检测仪。

1.3 方法

1.3.1 最佳检测波长和最佳测定时间 取以对数生长期的第3代兔成纤维细胞，以0.25%胰酶消化、计数、接种于接种于96孔培养板，每孔加入100 μl的细胞悬液，浓度为1×104个/ml，重复种植5个孔，在空白对照孔加入培养基100 μl，在96孔板的四周加PBS液100 μl，以保持96孔板的湿度。连续接种6个96孔板，在37 ℃恒温箱中培养24 h使细胞贴壁。CCK-8组每孔加入10 μl CCK-8试剂，在37 ℃恒温箱中分别继续孵育1、2、3、4、5、6 h后，用酶联免疫检测仪检测各组的OD值，检测5个孔的OD值，并取其平均值；检测MTT组时吸去上清液，并在每孔加入100 μl含MTT试剂的培养基，继续培养1、2、3、4、5、6 h，检测前先吸出孔内液体，每孔加入150 μl的DMSO液，振荡使其溶解，分别检测其不同波长下的OD值[4]。

1.3.2 细胞数量与吸光度的关系 取对数期生长第3代兔成纤维细胞，以0.25%胰酶消化、计数、接种于接种于96孔培养板，每个孔细胞浓度从高到低依次为4×104个/ml、

2×104个/ml、1×104个/ml、5×103个/ml、2.5×103个/ml、1.25×103个/ml、7.5×102个/ml、4×102个/ml、2×102个/ml，每个浓度种5孔，放入37 ℃恒温箱中培养24 h，细胞贴壁后，分别加入CCK-8试剂和MTT试剂，在酶标仪上测量其OD值。

2 结果

2.1 最佳检测波长的确定 如图1所示，用CCK-8法检测兔成纤维细胞活性时，在450 nm处的吸光峰值最高，CCK-8法检测时的最佳波长为450 nm。由图2可知，MTT法检测时的最佳波长为490 nm。

2.2 最佳测定时间的确定 从图1、图2可见，在加入MTT试剂和CCK-8试剂后，孵育1～6 h，用酶联免疫检测仪分别检测1～6 h的OD值，孵育1～4 h，OD值呈上升趋势，4～6 h OD值出现下降的趋势，孵育4 h时检测OD值最大，灵敏度最高。因此用MTT法和CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞的活性时，应该在加入MTT试剂和CCK-8试剂孵育后的4 h检测最佳[5]。

2.3 细胞数量与吸光度的关系 用两种方法检测细胞数量与吸光度的关系如图3所示。从图3可见，随着细胞浓度的增加，两种方法测得的OD值都增大，在103处OD值开始增加较明显，104处OD值接近峰值，随着浓度增加，OD值增加的不明显。

3 讨论

MTT法的优点：简单、方便、快速、无放射性污染、应用范围广。缺点：MTT法的中间代谢产物为不溶于水的结晶物，在加入有机溶剂前需要弃上清液，会造成一定的误差。而CCK-8法的中间代谢产物为可溶性的，且不需要弃上清液，操作相对较为简便[6]。

从图3可以看出，CCK-8法测得的OD值始终大于MTT法测得的OD值，另CCK-8法比MTT法对细胞浓度变化更敏感，测得的结果更为准确。本实验还探讨了MTT法和CCK-8法在测定兔成纤维细胞的最佳实验条件，MTT法的最佳检测波长490 nm，CCK-8法最佳检测波长为450 nm，两法的最佳检测时间均为加入试剂后4 h。适宜的细胞数量范围2×103～1×105个。

综上所述，CCK-8法较MTT法检测的灵敏度高，准确性好，是一种优于MTT法的检测兔成纤维细胞增殖活性的方法。

参考文献

[1] Tominaga H，Ishiyama M，Ohseto F，et al.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay[J].Anal Commun，1999，36（1）：47-50.

[2] Rassendren F，Buell G，Newbolt A，et al.Identification of amino acidresidues contributing to the pore of a P2X receptor[J].The EMBO Journal，1997，16（2）：3446.

[3] 朱晓弘.兔结膜成纤维细胞的体外培养[J].国际眼科杂志，2005，5（2）：253-255.

[4] 侯春梅，李新颖，叶伟亮，等.MTT法和CCK-8检测悬浮细胞增殖的比较[J].军事医学科学院刊，2009，8（4）：400-401.

[5] 熊建文，肖化，张镇西.MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较[J].激光生物学报，2007，10（5）：559-560.

[6] 辛陪成，杨圣.CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性之最佳测试条件研究[J]. 中外医学研究，2011，9（4）：6-8.

（收稿日期：2012-11-23） （本文编辑：陈丹云）