钟大妮等

【摘要】 目的：研究广西地区乙肝病毒基因型分布及与临床表现及机体免疫功能的关系。方法：收集广西地区原籍人口不同病情的慢性乙肝病毒相关性疾病包括无症状携带者（ASC）、慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、乙肝后肝硬化（LC）、原发性肝癌（HCC）血液标本，检测乙肝病毒血清学标志物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc和抗-HBcIgM），HBVDNA拷贝数，肝功能，T淋巴细胞亚群，型特异性引物巢式PCR及测序鉴定病毒基因型，利用统计软件SPSS 17.0进行资料分析。结果：本研究检测纳入的研究对象感染乙肝病毒为B、C两种基因型，未检测到其他基因型，以C型（66.3%）为主，B型（33.7%）次之。C基因型的HBeAg血清转换率低于B型（P<0.05）。C型在肝癌组的比例显著高于其他疾病组（P<0.05），不同基因型间年龄、HBVDNA拷贝数、AST、ALT、T细胞亚群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的差异无统计学意义。结论：广西地区乙肝病毒感染相关性肝病患者HBV基因型为B型、C型，以C型为主，C型与较严重病情有关，感染不同HBV基因型与机体的免疫状况无明显相关。

【关键词】 乙肝病毒； 基因型； 临床表现； T淋巴细胞亚群

乙型病毒性肝炎是危害严重的慢性传染性疾病，迄今全世界至少有3.5亿人感染乙肝病毒（HBV）[1]。广西是乙肝病毒的高流行区，人群中乙肝病毒的携带率基数大，乙型肝炎发病率约为60.5/10万[2]。慢性HBV感染致肝细胞炎症损伤，迁延反复，导致肝细胞坏死及纤维结缔组织增生，发展为肝硬化、肝细胞癌，严重威胁人类生命健康[3]。近年研究发现乙肝病毒可根据全基因序列差异>8%或S基因片段差异>4%分为A-H共8个基因型，在我国主要是B型和C型[4]；HBV传播方式、临床表现、疾病转归、抗病毒治疗效果与病毒的基因分型都有一定的相关性[5]。为了解广西地区乙肝病毒基因分型和致病性差异，病毒基因型和不同严重程度慢乙肝机体免疫功能的差异的关系，本研究收集了广西原籍人口无症状乙肝病毒携带者（ASC），轻、中、重慢乙肝患者（CHB），乙肝肝硬化（LC）以及肝癌（HCC）患者血清标本，进行不同疾病谱的HBV基因型分析及比较感染不同基因型的机体T淋巴细胞亚群情况。

1 材料与方法

1.1 材料 乙肝病毒标记物试剂盒（艾康生物技术（杭州）有限公司）；高速冷冻离心机（Eppenndorf Centeifuge，德国）；PCR扩增仪（PTC-220MJ Reaearch， USA）；DYY-2型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；紫外分析仪（UV-1700（E）230CE，日本岛津公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton-Kickin-son公司）；血清病毒DNA提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；PCR Mix缓冲液及超纯水（大连宝生物有限公司）；东胜Marker（上海东胜生物公司）；琼脂糖（日本TaKaRa公司）；FACSCount Reagent Kit（美国BD公司）引物设计参照文献[6]报道，分别为两条外引物P1、P1R；公用上游引物P2，A、B、C三型特异下游引物；公用下游引物P3R，D、E、F三型特异上游引物，共10条引物，由生工生物（上海）有限公司生产。血液样本来源于2008-2011年广西医科大学第一附属医院传染科门诊及住院部、肝胆外科住院部，广西医科大学肿瘤医院住院部患者，诊断符合2005年修订《慢性乙型肝炎防治指南》[7]，入选患者排除甲肝、丙肝、戊肝、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病。

1.2 方法

1.2.1 HBV marker（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）检测 严格按照酶联免疫吸附法试剂盒操作。对乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阳性者，送广西医科大学第一附属医院做荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数。

1.2.2 血清病毒基因型检测 血清病毒DNA提取按照试剂盒说明书。取2 μl乙肝病毒DNA提取液，巢式PCR方法参照文献，条件稍作改动[6]。在0.5 ml离心管中加入上下游外引物（50 pmol/L）各1 μl，25 μl PCR Mix，2 μl病毒DNA提取液，加21 μl超纯水至50 μl，轻微震荡混匀后，进行第1轮PCR扩增。取2 μl每一个样本的第一轮PCR产物加上A、B、C引物和对应的公用引物（50 pmol/L）各1 μl，PCR Mix、超纯水按照第一轮加入。在另一离心管D、E、F基因型的检测同前所述。将两组巢式PCR产物进行凝胶电泳，参照Marker得到产物的相对分子质量判断基因型，A型为68 bp，B型为281 bp，C型为122 bp，D型为119 bp，E型为167 bp，F型为97 bp。对不能用巢式PCR成功分型的样本送生工生物工程（上海）有限公司测序。并随机选择10个成功分型的样本测序以鉴别本实验分型的可靠性。

1.2.3 T淋巴细胞亚群检测 对慢乙肝组患者进行流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8：每个12×75 mm样品测定管加入50 μl抗凝血（EDTA-K2抗凝），各管加入10 μl三色单抗，轻微振荡混匀，室温避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解红细胞，轻微振荡，避光10 min，接着离心弃上清2次，加PBS后上机检测。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5（小鼠），作为阴性对照，其他步骤同上。每份标本测定5000个细胞，全部数据用流式细胞仪和软件SYSTEM II获取和分析。

1.3 统计学处理 HBVDNA先进行对数转换后再进行比较。统计学分析采用SPSS 17.0软件，计量资料以（x±s）表示，均数的比较采用t检验或F分析，率的比较采用 字2检验，双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究病例纳入情况 共收集病例ASC46例，CHB103例，LC58例，HCC46，所有病例乙肝表面抗原（HBsAg）均为阳性，排除病毒DNA拷贝数<1×103后，得到最后研究病例ASC 31例，CHB 85例（轻度17例，中度36例，重度32例），LC 30例，HCC 35例。男性144例，女性37例，年龄13～84岁。每个病例组的平均年龄、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乙肝病毒DNA拷贝数及乙肝病毒e抗原（HBeAg）的情况见表1。

2.2 HBV基因分型 将PCR产物在1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳，基因分型为B型或C型，未检测到B、C混合型，未发现其他基因型。将测序结果与NCBIGene数据库病毒序列比对得到测序的基因分型为B型或C型。所有病例中B型61例（33.7%），C型120例（66.3%），发病者主要集中在大于30岁的人群，C基因型的>30岁患者比重较大。各疾病谱基因分型及对应的指标值见表2。

2.3 各疾病谱基因型分布 HCC组 C型的比例（91.4%）均高于ASC（67.7%）、CHB（56.5%）、LC（63.3%），差异均有统计学意义（P<0.05）。ASC组、CHB组、LC组组内的C型比例较B型高，但组间分布差异无统计学意义。

2.4 乙肝病毒e抗原与基因型 B型组HBeAg（+）为36.1%，低于C型组的HBeAg（+）的60%，差异有统计学意义（P=0.002）。

2.5 乙肝病毒基因型与病毒DNA拷贝数 B型HBVDNA平均拷贝数为2.21×107，C型的为1.31×107，两者比较差异无统计学意义（P=0.333）。

2.6 乙肝病毒基因型与ALT、AST的关系 B基因型组与C基因型组ALT、AST差异均无统计学意义（PALT=0.486，PAST=0.673）。ASC、CHB、LC、HCC组内比较也发现ALT、AST与基因型无关。

3 讨论

据文献报道，我国流行的HBV基因型主要为B型和C型，但各地区基因型分布情况不尽相同。本研究发现，广西地区原籍人口中感染的HBV基因型主要为C型，其次为B型。据文献报道，北京、黑龙江及广东、河南、山西等多地区的主要流行基因型也是C型[8-11]，提示我国的主导基因型为C型，广西HBV基因型分布与全国一致。

本研究结果表明，广西地区原籍人口C基因型的乙肝病毒相关性肝病的发病主要是在25岁之后，这与Yin等[12]先前在国内做的社区调查的报道相似。广西是HCC高发区之一，本研究显示，HCC组C基因型的比例均明显高于ASC、CHB、LC组，表明C基因型与肝癌的进展密切相关[13]。对30岁以上的乙肝病毒携带者检测病毒基因分型有助于预测肝癌发病风险[14]。有研究报道，C基因型引起的肝脏疾病临床表现的严重程度较B型高，包括较高的肝癌术后复发率、延迟的血清转换、较高的DNA拷贝数、较高的ALT水平[14-15]；也有研究报道B基因型引起的临床表现较为严重[12，16]；Zeng等[17]报道B、C基因型的肝病严重程度包括肝功能、肝脏炎症、纤维化差异并无统计学意义。本研究中广西地区原籍人口C型HBeAg血清转换率显著低于B型的，提示HBV C基因型感染患者病毒的复制与感染性较B基因型高，但两种HBV基因型的ALT、AST及HBVDNA水平无显性差别。报道的不一致可能与地区分布的乙肝病毒流行特点、病毒亚型及患者的环境因素、生活习惯有关[18]。

一般认为，HBV致肝脏损害主要由机体对HBV免疫应答介导，肝细胞感染HBV后在细胞表面表达的病毒可引起细胞毒性T细胞反应，多种因素可影响这种免疫应答的强度，其中包括病毒遗传物质多态性[19-20]。为了解HBV基因型是否与机体T细胞免疫有关，本研究比较了慢性HBV感染相关性肝病患者B、C基因型外周血的T细胞亚群CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）的数量，结果表明，C基因型的CD3（+）、CD4（+）、CD8（+）T细胞与B型均无显著性差别，此结果可能与研究样本相对较小有关。综上所述，广西地区流行的HBV以B型、和C型为主，未见其他基因型，或B、C重叠情况。C基因型与较严重的HBV感染相关性肝病病情有关，HBV基因型与机体细胞免疫状态的关系仍需进一步加大样本量进行研究。

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（收稿日期：2012-11-23） （本文编辑：陈丹云）