颜 洪，张 琼，吴 丹，宋华培 (第三军医大学西南医院全军烧伤研究所，创伤烧伤复合伤国家重点实验室，重庆400038)

能量代谢障碍是缺氧导致细胞和组织器官损害的根本原因，因此缺氧条件下，细胞及时有效地启动内源性能量保护机制对保护细胞功能，提高细胞抗缺氧能力至关重要。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作为细胞能量状态的感受器和调节器在维持细胞能量稳态和适应性反应中扮演关键角色［1］。AMPK属于一组进化保守的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，由一个催化亚基(α)和两个调节亚基(β和γ)3个亚单位组成［2］。AMPKα亚基Thr172位点被其上游激酶(AMPKK)磷酸化是AMPK充分活化的主要标志和必要条件。本研究拟利用基因重组技术构建His-AMPKα312截短缺失融合蛋白，将其作为AMPK磷酸化激活的检测底物，为深入研究各种病理生理条件对AMPK活化的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠乳鼠原代心肌细胞;Tripure isolation reagent(TIR);Trizol RNA;ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit(TOYOBO);DNA Marker DL2000(TaKara);Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas);DNA回收试剂盒(TIANGEN);质粒小提试剂盒(Axygen);AMPK-αpan抗体，磷酸化 AMPK-α抗体(Upstate);PCR 仪(ABI PCR System 2700);高速低温离心机(Beckman);凝胶成像分析系统(BioRad)。Anti-His Antibody购自天根生化科技(北京)有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)及二硫苏糖醇(DDT)购自BBI公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建和蛋白表达检测 AMPKα1基因扩增:取新生Wistar大鼠心室肌，0.125%胰蛋白酶消化分离，置入含15%小牛血清的DMEM培养基的培养皿中，利用差速贴壁法除去非心肌细胞并加入5-溴脱氧尿嘧啶0.11 mmol/L以抑制非心肌细胞增殖。培养48 h后收获细胞，Trizol试剂提取细胞总 RNA，以其为模板，按 ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit试剂盒说明书操作，经逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，cDNA第一链为模板，进行PCR扩增获得1 011 bp的prkaa1(即AMPKα1基因)大片段基因。引物是根据prkaa1大片段基因序列自行设计，引物序列见表1。反应条件为:94℃变性5 min，然后开始PCR循环:94℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，共35个循环，72℃延长10 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 引物序列

目的基因的克隆:①prkaa1-936目的基因片段的扩增。PCR扩增prkaa1-936目的基因的引物是根据prkaa1-936基因序列自行设计，并在片段末端加有终止密码子，片段左右两端分别加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，引物序列见表1。扩增片段大小为936 bp。反应条件为:94℃变性5 min，然后开始PCR循环:94℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，共35个循环，72℃延长10 min，4℃保存。DNA电泳观察鉴定。②扩增所得片段连接T载体并测序。切胶，用回收试剂盒回收扩增片断。并连接 T-vector，回收产物 4.5 μl，T-vector 0.5 μl，Solution Ⅰ 5 μl，4 ℃过夜。连接产物转化 DH5αE.coli，涂 LB(Kan 抗性)平板，37℃过夜。挑取单个菌落，接于3 mL LB(Kan抗性)液体培养基中，37℃摇床过夜。用小提质粒试剂盒提取质粒，分别用HindⅢ和XbaⅠ双酶切和BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，1%琼脂糖电泳检测，所提质粒正确。编号YH2。

重组表达质粒的构建:将YH2质粒和PET28a(+)分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，分别回收酶切片断，反应体系:YH2回收产物 4.5 μl，PET28a(+)回收产物 0.5 μl，Solution I 5 μl，4℃过夜。连接产物转化DH5αE.coli，涂LB(Kan抗性)平板，37℃过夜。挑取单个菌落，接于3 mL LB(Kan抗性)液体培养基中，37℃摇床过夜。用小提质粒试剂盒提取质粒，分别用HindⅢ和XbaⅠ双酶切和BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，1%琼脂糖电泳检测，所提质粒正确。编号YH2/PET28a(+)。

目的基因的诱导表达与检测:取100 μl YH2/PET28a(+)菌液接于4 mL LB(Kan抗性)液体培养基中，37℃摇床培养至OD600在0.6～0.8，加入IPTG 诱导3 h，分别取诱导前和诱导后的菌液作SDS-PAGE检验。

1.2.2 AMPKα1312蛋白纯化 将构建成功的 prkaa1 表达菌株200 μl接种 LB 培养基800 mL，37 ℃，250 r/min离心，过夜培养，加诱导剂IPTG至浓度1 mmol/L，继续培养4 h。5 000 r/min离心15 min，离心收集菌体，15 mL PBS缓冲液重悬菌体，于冰浴超声破碎菌体后，12 000 r/min离心15 min，分别收集上清和沉淀。取上一步骤收集的沉淀，分别用2、4、8 mol/L尿素溶解，12 000 r/min离心15 min，取其上清制备电泳样品。另外，第一步的菌液(记为大样)和第二步的上清(记为上清)也分别制备电泳样品。电泳样品行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将沉淀用3 mL 8 mol/L尿素溶解后，过镍琼脂糖凝胶柱，50 mmol/L咪唑溶液洗涤，300 mmol/L咪唑溶液洗脱并收集纯化蛋白prkaa1，行10%SDS-PAGE检测蛋白纯度。

1.2.3 重组蛋白的Western blot鉴定 将纯化的重组蛋白行10%SDS-PAGE后，采用半干转膜法转印至 PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h。以AMPK-pan α抗体(1∶1 500稀释)，37℃ 孵育2 h。以HRP标记的羊抗兔 IgG(1∶10 000稀释)为二抗，孵育1 h。洗膜后于凝胶成像仪显影。

2 结果

2.1 目的基因的获得

在prkaa1大片段基因RT-PCR扩增的基础上调取prkaa1-936目的片段。DNA电泳观察鉴定:取10 μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，用DL2000 Marker作为DNA分子量标准带，溴乙锭染色，紫外透射仪上观察并照相。结果见936 bp出现特异扩增条带(图1)，与所需目的基因大小吻合。

2.2 重组质粒的双酶切鉴定及基因测序分析

将PCR产物和表达载体PET28a(+)分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，连接过夜，连接产物转化DH5αE.coli。挑取单个菌落，用小提质粒试剂盒提取质粒，转化分别回收酶切片断，分别用HindⅢ和XbaⅠ双酶切和BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，1%琼脂糖电泳检测，所提质粒正确(图2)。阳性克隆送Invitrogen生物技术有限公司(上海)测序，结果证实所扩增的prkaa1基因序列完全正确，与GenBank数据库收录序列完全一致，并准确插入表达载体。将该重组质粒命名为YH2/PET28a(+)。

2.3 目的蛋白的诱导表达及纯化

将构建成功的prkaa1表达菌株通过摇菌、破菌。取100 μl YH2/PET28a(+)菌液接于4 mL LB(Kan抗性)液体培养基中，37℃摇床培养至OD600在0.6～0.8，加入IPTG诱导3 h，收集的沉淀，分别用2、4、8 mol/L尿素溶解做SDS-PAGE检测。结果见prkaa1是以包含体形式表达，并且大部分溶解于8 mol/L尿素(图3a)。将沉淀用3 mL 8 mol/L尿素溶解后，过镍琼脂糖凝胶柱，50 mmol/L咪唑溶液洗涤，300 mmol/L咪唑溶液洗脱并收集纯化蛋白prkaa1，行10%SDS-PAGE检测蛋白纯度，结果显示如图3b。

2.4 重组蛋白的 Western blot鉴定

Western blot分析显示，纯化的重组蛋白可与兔抗大鼠AMPK-αpan抗体特异结合，在相对分子质量约38 kD处可见明显反应条带，见图4。表明纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。

3 讨论

图1 prkaa1-936 PCR产物电泳

图2 重组质粒的酶切鉴定

图3 His-AMPKα1312截短缺失融合蛋白的表达与纯化

图4 AMPKα1312纯化蛋白的Western blot检测

近年来的研究证明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作为细胞能量中心感受器和效应器在维持细胞能量稳态和缺氧适应性反应中扮演关键角色。当各种营养或环境应激如:运动［3］，饥饿［4］，氧化应激［5］，以及缺血缺氧［6］等应激导致细胞内ATP下降，细胞能荷降低时(即ATP∶AMP比值降低)，AMPK即被 AMP变构激活。除了被AMP变构激活外，AMPK还可被其上游激酶 AMPKK 磷酸化激活［7］，AMPKK 使 AMPKα 亚基Thr172位点磷酸化从而导致AMPK显著激活(超过50倍)，该激活程度显著高于AMP变构激活［8］。更重要的是，AMPK也可被一种或多种上游激酶(AMPKK)磷酸化激活，其关键的磷酸化位点是位于α亚基激活环中的Thr172残基，该位点的磷酸化对于AMPK活化是必须的，如果该位点缺失或没有被磷酸化则AMPK将不具有任何可检测的活性［9-10］。

截短的AMPKα1312虽然不能再与β和γ亚基结合形成异三聚体，但其不仅含有AMPK的关键磷酸化位点，同时也保留了大部分的激酶活性，是深入研究不同病理生理条件下细胞内AMPK以及其上游激酶AMPKK活性的重要手段。

本研究利用原核表达系统成功表达并纯化了具有生物活性的 AMPKα1312蛋白，本实验中获得的重组AMPKα1312截短缺失蛋白主要以包含体形式存在，需要进行蛋白复性，我们利用梯度稀释透析的方法使包含体蛋白重新折叠复性，经体外实验证明，其保持了较好的生物活性。本实验采用的是相对小分子质量的His作为标签，便于 Ni-NTA柱亲和层析纯化，对重组蛋白的空间构象和蛋白活性影响相对较小，不需要后期酶切，实验操作更加简单、方便。经SDS-PAGE和Western blot分析表明，该蛋白为大鼠AMPKα1截短缺失融合蛋白反应原性正确。深入研究各种病理生理条件对AMPK活化的影响奠定基础。

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