杨明超 杨利琴 黄 猛

（1.云南省盈江县动物卫生监督所，云南盈江 67900；2.云南农业大学，云南昆明 650201；3.云南省盈江县那邦畜牧兽医站，云南盈江 67900）

禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒（AIV）引起的一种家禽和野禽的感染或疾病综合征，鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽、野鸟、水禽和海鸟等均可感染。这种高度接触性的传染病可呈无症状感染、不同程度的呼吸道症状、产蛋率下降，以至引起头冠和肉髯紫黑色、呼吸困难、下痢、腺胃乳头和肌胃角膜下等器官组织广泛性出血、胰脏坏死、纤维素性腹膜炎甚至100%致死率的急性败血症[1]。野鸟或者侯鸟是AIV的自然宿主，现已证实禽流感病毒可以由家禽直接感染人，具有重要的公共卫生学意义。根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性的不同，可将禽流感病毒分为16个HA亚型[2]和9个NA亚型。其中H5亚型和H7亚型为高致病性禽流感（highly pathogenic Avian influenza，HPAI），传播迅速，病程短，可引起家禽大批死亡，给养禽业造成严重损失[3-4]。此外，越来越多的证据表明，HPAIV还可以突破种间障碍，感染人并造成发病和死亡[5]。因此，世界动物卫生组织（Office international des epizootics，OIE）将HPAI列入必须向通报的OIE疾病名录，我国也将其定为一类动物传染病[6]。

在禽流感的防治过程中，快速诊断技术非常重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验等检测禽流感的方法，因敏感性不高或检验时间较长，不能满足现实检疫和疫病防制的需要。为了更好地防制禽流感，科学工作者一直在寻求建立一种特异、快速的诊断方法，分子技术诊断方法具有高度特异性、高度敏感性、快速省时、对样品的要求不高等优点。禽流感病毒的基因组含有8个RNA片段，其中，NP蛋白的基因是禽流感的型决定基因，HA、NA蛋白的基因是亚型决定基因，现有分子技术诊断方法，主要针对NP、HA、NA基因的核苷酸序列建立快速诊断方法。

1 病毒的分离培养

病毒的分离培养是检测禽组织中AIV的一种经典、准确、敏感的病原学诊断方法。目前常用的方法有鸡胚分离培养和细胞培养，可以作为AIV检测的标准。但该方法的检测周期长，操作程序繁杂，不适用于该病的快速诊断。

2 血清学检测

利用抗原与抗体在体外和体内均能发生特异性结合的特性设计的检测抗原或抗体的一系列检测技术，均称为免疫学检测技术。由于在体外进行反应时，一般用含有抗体的血清进行，所以又称为血清学技术，常用的AIV血清学检测技术有以下几种[7]。

2.1 血凝试验与血凝抑制试验

AIV囊膜表面的血凝素能凝集多种动物的红细胞，这种凝集特性能被特异的血清抑制。血凝（HA）试验主要用于AIV的常规检测，血凝抑制（HI）试验可用于AIV的鉴定和血清中AIV抗体浓度的测定[8]。HI试验具有较高的特异性和敏感性，但在做HI试验时，需要先去除血清中的非特异性的凝集因素，同时，需要对抗原进行标准化。目前，WHO一般采用此方法进行全球流感病毒的监测。

2.2 琼脂扩散试验

琼脂扩散（AGP）试验一般用来检测AIV的共同抗原核蛋白或基质蛋白[9]，哈尔滨兽医研究所禽流感研究中心研制的常规琼扩抗原和重组抗原已广泛应用于30多个省市自治区的鸡群AIV疫情监测中，效果良好[10]。

2.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术（IFA）是将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原抗体反应。此技术最早用于鉴定和定位流感病毒感染细胞中的特异性抗原，主要是NP或MP抗原。检测NP抗原主要出现核内荧光，检测MP抗原主要出现胞浆荧光，核内也有部分荧光[9]。该技术具有快速、简便、敏感等特点，而且成本低，在流感暴发期间，比病毒分离鉴定更适合于快速诊断AI。

2.4 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）方法具有较高的敏感性和特异性，既可以检测抗体，又可以检测抗原，尤其适用于大批样品的血清学检测。国内外大多采用间接ELISA和竞争ELISA检测鸡群抗体水平【7】。李海燕等利用混和纤维素酯微孔滤膜建立了斑点ELISA，该方法不仅敏感性和特异性好，而且结果易于判定，非常适合现场AIV抗体的检测及流行病学调查。

抗原的纯度直接影响到ELISA方法的敏感性和特异性，王传彬等[17]对构建的3株H5亚型的HA单抗进行亲和层析纯化，用长臂活化生物素进行标记，建立了检测H5亚型AIV的单抗介导、生物素放大的捕获ELISA。该检测体系的灵敏度高，能检出0.25个血凝单位的H5亚型血凝素抗原。

最近随着生物传感器的快速发展，国内出现了用于AIV快速检测的蛋白芯片的报道。

2.5 神经氨酸酶抑制试验

神经氨酸酶抑制试（ NIT）根据A型流感病毒的表面抗原特性，特别是血HA和神经氨酸酶（NA）特性，可通过NIT试验进行鉴定。NIT试验的一种改进法——平板微量NIT试验，虽不能提供常量法的定量，但却是A型流感病毒的病毒分类和抗体检测的快捷方法。该方法不仅降低了抗原用量，而且可对多种分离物同时进行抗原分类。试验证明，微量NIT试验能对分离物做出准确鉴定，而常量NIT试验检测亚型混合物更敏感。

2.6 病毒中和试验

禽流感病毒中和试验（VN）的操作与其他病毒（如NDV）的中和试验相似。Thomas R等[7]报道，他们建立的用于AIV H5N1检测的微量中和试验的敏感性要高于HI试验，如同时结合运用H5型特异的Western blotting试验，其敏感性可达80%，特异性可达96%。

3 回顾与展望

随着分子技术的发展，分子生物技术已被大量应用于禽流感的快速诊断，但现有的分子生物学方法的敏感性方面仍不及传统的鸡胚分离法。一直被看好的RT-PCR-ELISA的敏感性方面已超过了鸡胚分离法，但需进行PCR和ELISA2种方法的检测，其操作较繁琐，用于禽流感诊断需7 h以上，且用ELISA对PCR产物进行检测时需打开PCR反应管，与普通电泳检测一样，实验室经长期检测后，因扩增产物的污染而导致的假阳性将难以克服，要普及用于禽流感的快速诊断尚需进一步的优化与完善。荧光PCR方法虽然敏感性方面较鸡胚分离法低，但操作简便（经RNA抽提后，加样上机即可自动出结果），荧光检测过程中无需打开PCR反应管，较好的解决了扩增产物的污染问题，已能完全满足临床样品的检测需要。NASBA方法的敏感性接近了鸡胚分离法，因扩增产物是RNA，容易被降解，而克服了污染问题，也已满足临床样品的检测需要，所以荧光PCR和NASBA方法将在禽流感快速诊断方面起重要的作用。

[1]李海燕，辛晓光，田国斌，等.间接酶联免疫吸附试验检测禽流感抗体的最佳条件[J].中国畜禽传染病，1998，（4）：233～235.

[2]李海燕，辛晓光，田国斌，等.禽流感班点-ELISA诊断技术的研究[J].中国预防兽医学报，1999，21（5）：321～324.