张维珍

（长春市农科院畜牧研究所，吉林长春 130111）

布鲁氏菌病（Brucellosis简称：布病）是由布鲁氏菌引起的一种动物传染源的人畜共患传染病。在全世界范围内广泛流行，WHO估计布病每年新发的病例是50万人，是全世界范围内最频繁发生的人畜共患传染病之一[1]。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，它的重要特征是网状内皮细胞系统持续的细菌增殖，因此，了解布鲁氏菌在细胞内的生存和免疫入侵机制是掌握布氏杆菌病致病性的关键。近年来，许多研究都在布鲁氏菌与宿主相互作用关系方面取得进展，这使得我们对布鲁氏菌细胞内生存和免疫入侵有了一定的认识。本文对布鲁氏菌和宿主相互作用机制的研究概况进行了综述，着重介绍了病原性布鲁氏菌持续性增殖的细胞内生存和免疫入侵机制。

1 侵入宿主

牛种和羊种布鲁氏菌侵入宿主主要是通过消化道系统或呼吸道途径，但是他们也能通过皮肤黏膜接触感染。小鼠通过呼吸道途径感染羊种布鲁氏菌比通过胃内感染高104倍。尽管两者存在着显著的差别，但流行病学调查显示大部分人类感染的病例都是通过食物传播的。可能的原因是，人通过污染的牛奶和奶酪感染羊种和牛种的布鲁氏菌的情况比职业性的接触气溶胶感染的情况要更普遍[2～3]。

通过胃肠道感染的研究已经证实，感染的过程是细菌和宿主的因素共同起作用的结果。牛种、羊种和猪种布鲁氏菌的基因编码有两个尿素酶（Ure）。缺乏Ure1的突变体不能通过胃内途径有效的在小鼠体内增殖，这个结果揭示，Ure1在通过消化道感染而不是全身感染的过程中发挥着特殊的作用[4～5]。尿素酶可能通过尿素产生CO2缓冲胃内的低pH值发挥作用，有趣的是，缺乏尿素酶的绵羊附睾种布鲁氏菌虽然也能在羊奶中存在，但是不能通过食物传播感染人类，尿素酶可能也对人类的感染非常重要[6]。一旦布鲁氏菌通过了胃，它们必须通过上皮组织障碍分散到全身。在结扎的小鼠和牛身上研究发现，牛种布鲁氏菌定植在淋巴集结的固有膜下，说明淋巴集结是细菌进入的港口[7～8]。体外研究羊种布鲁氏菌运送极化的人类上皮（包括M样细胞）单层细胞结果显示，M样细胞是布鲁氏菌通过黏膜表面分散全身的一条途径[9]。

2 散布全身的各部位

2.1 布鲁氏菌逃避免疫系统检测的机制

最近的研究显示布鲁氏菌用主动和被动的机制来逃避固有免疫系统Toll样受体的检测[10]。连同NLRs家族，这些病原体识别受体像一个分子条形码阅读器一样发挥功能，使宿主通过识别保守的病原生物表面的病原体相关分子模式（PAMPS）典型的组合来区别细菌和其他感染性病原体[11～12]。布鲁氏菌被动逃避TLR4受体的检测是通过LPS的脂质A的改变实现的。牛种布鲁氏菌脂质A包含比肠道细菌LPS（C12～C16）更长的脂肪酸残基（C28），同时这个改变通过降低的布鲁氏菌LPS的TLR4活性剂的活力极大地减少内毒素成分[13]。另外，布鲁氏菌LPS的抗炎症的特征是抵抗补体C3的沉积。C3沉积导致过敏因子C3a和C5a的产生，这些过敏因子和TLRS对减少促炎症的细胞因子起协同作用[14～17]。因此，布鲁氏菌LPS的结构特征允许它去逃避依靠TLR4和补体两个不同的固有的检测系统。

除了被动的逃避固有免疫，牛种和羊种布鲁氏菌调配一个能有效干扰TLR信号的蛋白。活菌感染的过程中，TLR2，TLR4和TLR9对感染是非常重要的[18～20]。牛种基因组编码两个蛋白包含TIR受体区域：Btp1和BAB1-0756编码的蛋白。Btp1抑制树突状细胞的成熟和促炎性细胞因子的产生。这种抑制是它能够干扰布鲁氏菌释放TLR2和TLR4信号的结果，但它并没有抑制TLR9信号。羊种布鲁氏菌同等物质TcpB。TcpB的异位表达导致聚泛素化和MAL的降低，TLR2和TLR4发出信号需要一个适配器，而TLR9则不需要[8，20～21]。

2.2 细胞内生存

已经证实，布鲁氏菌在宿主巨噬细胞和树突状细胞内生存。巨噬细胞依靠细菌是否已受抗体的调节作用通过两种不同的途径吸收猪种和牛种布鲁氏菌。存在脂质筏的条件下，吸收不易受调节作用的细菌被认为是在缺乏特异性抗体的感染早期发生的。有研究提出，布鲁氏菌吸收的巨噬细胞有两个受体：一个是和LPS相互作用的SR-A受体，另一个是牛种上绑定表面暴露的Hsp60的细胞内PrPC[22～23]。布鲁氏菌的调理作用导致巨噬细胞吸收细菌增加了10倍，但是吞噬细胞吞噬正在复制的细菌的百分率被降低了。

细胞吸收猪种布鲁氏菌后，液泡pH酸化到4.0～4.5。这个酸化过程是非常重要的，因为用洛霉素A和氯化物中和细胞液泡的pH值可以抑制猪种布鲁氏菌细胞内的复制[24-25]。其中一个原因是酸化的环境提供了一个在巨噬细胞和树突状细胞内布鲁氏菌非常重要的细胞内复制的毒力因子VirBⅣ型分泌系统降低的信号。

在巨噬细胞里，含有布鲁氏菌的细胞液泡在吸收后开始被溶菌体融化。和酸化过程一样，溶菌体融化对于复制室的发展也非常重要，因为阻碍了后期的伴随阴性主导的突变体降低布鲁氏菌细胞内复制的GTP酶Rab7的功能发挥。因此，减少T4SS表达的液泡的酸化是一个细胞内复制的要求[26]。分泌的效应器，一旦溶菌体和包含布鲁氏菌的液泡融合，VirB T4SS可能限制溶菌体融合的程度或者排除溶菌体标记物，因为VirB突变体残留在溶菌体内而且也被降解。截至目前，已经报道了T4SS的6个基层，包括VirB共调节因子A和C，和4个布鲁氏菌公认的效应器，BPE123，BPE275，BPE005，和BPE043[27]。第二个布鲁氏菌毒力因子是周质的环状葡聚糖，它已经被涉及到吞噬溶菌体融合物。纯化的环状葡聚糖能从细胞的外膜中释放胆固醇，打破脂质层的组织结构，表明在细胞感染过程中，从细胞外周质中释放的葡聚糖能打破富含吞噬体外膜富含胆固醇的微区，从此影响囊的白细胞聚集[28]。

在穿过晚期的胞小体后，布鲁氏菌变成和粗糙型的内质网（ER）相关，而且在ER源的液泡中复制[29]。ER在蛋白的分泌物中发挥作用，这个途径中关键的一步是运输泡从ER中出芽，即运输分泌物到高尔基体中。运输泡的出芽发生在ER叫做ER逃逸区的位置上，而且这个过程需要小的GTP酶 Sar1[30]。通过降低Sar1的活性，感染牛种布鲁氏菌的巨噬细胞ER逃逸区的破坏可以阻止ER标记物在含菌的液泡中的标记物，同时也可以抑制细胞内细菌的复制。从这个结果中看出，牛种布鲁氏菌定位到ER上依靠的是从ER出口区拦截膜的。除了许多ER蛋白以外，小的GT Rab1和Rab2和GAPDH已经被确认在液泡里含有布鲁氏菌。这三种蛋白普遍地在ER到高尔基体的媒介物中（ERGIC），这个媒介物由被认为是在ER和高尔基体之间的膜转运的分类拣选的微管泡系统结构组成。ERGIC的成熟要求的Rab2被布鲁氏菌最大化的细胞内复制所需要，因为它能阻碍Rab2和隐性突变体或和小干扰RNA共同发挥功能。和保守蛋白A（RicA）相互制约的羊种布鲁氏菌Rab2蛋白，最近已经被证实被定位到宿主细胞中，在宿主细胞中和Rab2的GDP上升方式相互制约[31]。虽然，RicA- Rab2相互作用的序列并没有完全被了解，但是ricA突变体的表型在宿主细胞中被增加复制了。这个发现表明RicA- Rab2相互作用可能影响包含布鲁氏菌的液泡以一种细胞内复制的方式成熟，从而有助于布鲁氏菌和先天免疫系统“隐形”的相互作用。

为了完成细胞内复制而拦截在ER和高尔基体之间的膜转运的特性是和另一个病原菌——肺炎军团菌相一致的。然而，布鲁氏菌锚定的ER的机理似乎和肺炎军团菌不同，它需要的是Rab1而不是Rab2，因为Rab2并不能定位到含有肺炎军团菌的液泡中。敲除Rab1对布鲁氏菌的细胞内复制并无影响，表明布鲁氏菌和肺炎军团菌调动了不同的蛋白完成同时的复制过程。尽管，可能在两个细胞内病原体之间的全部的策略中有着平行的出口，然而，肺炎军团菌T4SS效应器调节Rab1的GTP酶的活性，布鲁氏菌可能利用一个相似的策略去调节Rab2的活性和捕捉来自ER的膜的转运[32～33]。

尽管布鲁氏菌能大量的复制和获得大量的膜在感染细胞里，野生型布鲁氏菌的感染并不能导致细胞死亡。感染的细胞经历正常细胞的分化，表明基本的细胞的过程并没有因为布鲁氏菌的感染而受到影响[34]。而且，在感染的巨噬细胞中，被化学刺激物诱导的猪种布鲁氏菌能抑制了正常的细胞死亡或凋亡。虽然，布鲁氏菌抑制感染细胞的凋亡的正确的机理并不十分清楚，但是细胞内的复制似乎是需要的。两个研究发现了关于布鲁氏菌感染细胞得出的对细胞凋亡的感染诱导抑制作用的机理。第一个发现是，BCL2A1的正调节，它是有抗细胞凋亡活性BCL2凋亡基因家族的成员。第二个发现是，在线粒体里羊种布鲁氏菌的感染负调节了基因的表达，这个基因的表达在减少细胞凋亡过程中发挥关键作用。牛种布鲁氏菌突变体缺乏完整的LPS O链多聚糖不能抑制细胞凋亡，而且事实上却诱导了细胞毒性。这个影响作用在细胞上依靠的是T4SS，但是它也可能和O链多聚糖在抑制TLR信号转导中的作用相关[35～36]。

2.3 布鲁氏菌在免疫应答上的作用

布鲁氏菌感染的免疫应答特征在小鼠身上被广泛的描述了。和人类身上的感染情况相同的是，布鲁氏菌感染的鼠类的单核噬菌细胞系统和在缺乏抗生素处理的情况下，布鲁氏菌能持续的存在数月而不引起严重的发病和死亡。在小鼠感染的早期，宿主的应答类似于一个TH1的应答，和通过T细胞和NK细胞的的IFN-γ的产生一样。在小鼠身上，CD4+和CD8+T细胞有助于布鲁氏菌感染的控制，这可能反映它们作为IFN-γ的来源的角色。这种早期的TH1的反应是非常重要的。因为，IFN-γ缺陷的小鼠，例如敲除IFN-γ的小鼠和缺乏IRF-1调节因子的小鼠，都不能够控制小鼠全身的细菌感染而且也失败于克服牛种布鲁氏菌的感染。在体内，布鲁氏菌诱导的炎性反应比已经发现的例如沙门氏菌病的化脓的感染更加广泛，它反映了布鲁氏菌逃避固有免疫系统检测的能力。小鼠身上早期免疫应答的转录图谱表明T4SS对于减少IFN-γ和其他IFN-γ的产生发挥了重要的作用。尽管和它们的同基因的野生型毒株一样在脾脏中存在相同的数量，virB突变体失败的引起任何炎性反应。与布鲁氏菌IV型分泌系统相关的促炎性表型，已经发现和T4SS和其他病原体的III型分泌系统，包括肺炎军团菌的Dot/Icm T4SS、幽门螺杆菌的慢性萎缩性胃炎毒力岛T4SS和沙门氏菌的毒力岛（SPI-1）和SPI-2 T3SS，它们的活性都被细胞质的先天免疫系统感应器，包括Nlrc4，Nlrp3，Naip5，和Nod1检测到。因此，可能布鲁氏菌的VirB T4SS通过改变位置引起促炎性反应，或者通过保守的细菌的配体或是通过细胞质的固有免疫接受器来启动促炎性信号T4SS效应器[37～39]。

除了诱导早期的TH1反应，牛种布鲁氏菌也诱导抗炎性细胞质白介素10（IL-10）。IL-10能由CT淋巴细胞，B淋巴细胞和巨噬细胞产生，同时能抑制巨噬细胞抗布鲁氏菌的抑菌活性，和IFN-γ的反抗的活性。B细胞可能是IL-10的重要来源，因为缺乏B细胞的老鼠更可能限制牛种布鲁氏菌的感染[40]。牛种布鲁氏菌脯氨酸消旋酶（PrpA）已经显示了发挥B细胞引起丝状分裂的活性和通过生脾细胞诱导的IL-10分泌系统。总之，这些研究都表明了布鲁氏菌阻碍有效免疫反应的策略，它可能是诱导产生B细胞的IL-10的扩张。

虽然小鼠模型已经提供了关于布鲁氏菌病引起的免疫反应的重要观点，对小鼠的巨噬细胞和DC细胞的研究都得出了和人类相似的结果，但是并不是所有人类对布鲁氏菌免疫反应的关键因素都能在小鼠体内被研究。布鲁氏菌病病人和人类初级细胞的研究已经证实了人类特异的宿主反应的因素。例如，鉴于鼠科动物NK细胞对于控制牛种布鲁氏菌感染并不十分重要，人类的NK细胞可以调节依赖性接触的猪种感染的巨噬细胞[41]。而且，人类特异的T细胞（Vγ9Vδ2）能杀死感染猪种的巨噬细胞通过释放抗微生物的多肽类。因此，关于研究人类和鼠科系统的研究将被证明是有价值的，同时也是对于阐明人类布病对于人类免疫反应的编排的补充[42]。在人类慢性感染的过程中，起初的TH1反应衰退了，获得了TH2反应的特征，例如IL-13产生的T细胞的增加。慢性布鲁氏菌病病人不能表现一般免疫抑制的特征，因为他们的细胞仍然能对引起丝状分裂物的刺激物引起反应。潜在的对于免疫反应的TH极化的机理是很难理解的，对于推测在慢性感染过程中固有免疫刺激的低水平是非常诱人的，它可能是不能对维持一个有效免疫反应提供信号。

3 宿主的向外传播和排出布鲁氏菌

布鲁氏菌能被传播出去，在带菌者中或者通过垂直传播、通过污染的牛奶、胎盘或者是水平传播，通过生殖器接触、与其他发生流产的动物的接触传播。虽然牛种布鲁氏菌通过流产胎儿传播是牛布病的特征，但是从宿主中排出而且传播可能是我们在分子水平上了解的最少的阶段。在妊娠过程中，对于来自母体的抗原在正在发育的胎儿身上产生免疫耐受，导致在感染部位和全身的免疫反应，同时也转移免疫反应朝着Th2的方向偏离[43]。因为Th1的反应可以控制布鲁氏菌的感染，这个转移也提供了一个免疫环境，它对于控制细胞内的病原菌布鲁氏菌是不利的，而且它也允许细菌在全身各部位持续存在，例如从脾和淋巴结进入血液循环，同时也在妊娠的子宫内增殖。牛种布鲁氏菌在胚胎滋养层中复制，这个部位和巨噬细胞相似，已经发现这和ER相关[44]。增殖能导致最终发生胎盘炎和后期妊娠的流产。牛胎盘的移植模型已经被用于对宿主对牛种布鲁氏菌感染的研究中，而且它也可能是一个分析细菌感染的有用的工具，它要求的是定位和在胎盘滋养层中的复制。

布鲁氏菌对于妊娠胎盘的趋性可能是赤藓糖醇（首选碳源）的存在，因为布鲁氏菌用磷酸戊糖而不是糖酵解途径去破坏碳源，它可以获得比通过糖酵解途径获得碳源的两倍的能量。然而，在赤藓糖醇利用、妊娠胎盘的趋性和流产的因果关系还没有明确的建立。在这个方面，能引起狗流产的犬种布鲁氏菌不能利用赤藓糖醇作为碳源，所以如果牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌利用赤藓糖醇也在胎盘定位和流产方面起到重要作用，它可能和其他新陈代谢旁路途经和引起流产的各种型布鲁氏菌的毒力机制起到增效作用[45]。

4 展望

布鲁氏菌逃避和推翻固有免疫反应的关键策略是持续的感染。大量的研究结果阐明，布鲁氏菌调节宿主细胞的白细胞聚集到细胞内生存，同样也理解了逃避固有免疫系统的分子基础。但是我们对于布病致病机制的了解还远远不够，随着多株布鲁氏菌全基因组序列的测序完成，未来必将有很多高通量的新的研究方法应用于布鲁氏菌和宿主相互作用关系。例如：基于RNA-Seq技术研究布鲁氏菌及宿主的细胞转录学，这项研究必将进一步加深我们对目的靶基因功能作用及布鲁氏菌致病机理关系的理解。

略）