曾 琨 成洪波 应方微

（深圳市眼科医院，广东 深圳 518040）

人Tenon's囊成纤维细胞的培养和鉴定

曾 琨 成洪波 应方微

（深圳市眼科医院，广东 深圳 518040）

目的 分析对人 Tenon's 囊成纤维细胞进行培养与鉴定的优良方法。方法 实验选择白内障手术患者中的结膜 Tenon 囊组织块，培养成纤维细胞，选择第 5～9 代细胞，放置于培养皿中，进行贴壁培养，等待细胞成长至 70%～80% 的亚融合状态后按照浓度分别为 TGF-β1(0μg/L，2μg/L，5μg/L，10μg/L，20μg/L)、静置时间为 (24h、48h、72h)进行不同程度诱导，实现纤维细胞表向肌成纤维细胞的转换。结果 对所选人Tenon 囊组织块进行 5～7d 的贴壁培养后，观察细有梭形 HTF 长出，再经过 1 ∶ 2 的传代增值后，大约 3～4d 后培养器皿整个瓶底便会长满，大约 5d 时间 HTF 可实现汇合状态。HTF 放置 24h 之后 (TGF-β1为 0μg/L)也没有着色反应，即为阴性。采用浓度分别为 2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L TGF-β1对 HTF 进行诱导 24h 之后，α-SMA 出现了紫红色着色现象，变现为阳性。结论 通过对原代培养 HTF 进行多次传代后，发现原第3～5代细胞具有较强的活力，并且传代后的细胞增殖能力比较稳定，可作为医学界开展滤过泡抗纤维化研究的优良靶细胞。

纤维细胞；培养；鉴定

青光眼为一种不可逆的且可导致患者失明的危害性极大的眼病，全球范围内可排第 2 位，目前临床上对于青光眼的治疗方法中以滤过手术最为常见，主要因为滤过手术对于降低眼压的效果比较明显。然而，滤过手术的成功率不高，虽然随着医学技术的不断改进，手术方式也得到了改善，并且在术后采用了较好的抗代谢类药物，现阶段滤过手术仍然存在15%～25%的失败率[1]。主要是因为手术做完之后滤过泡的出现痕化不利于患者康复。目前对于滤过手术后出现的泡瘢痕的形成原理仍在进一步探讨和研究中，现有的文献资料认为病理性瘢痕的产生与修复细胞（以成纤维细胞为主）的大批量的繁殖与死亡抑制、合成细胞外基质（ECM）与降解失衡以及产生大量部分细胞因子有着极为密切关联。此外以上环节要想顺利展开都是建立在人Tenon囊成纤维细胞（HTF）的重要基础之上。如此看来，要想更好的对抗滤过泡瘢痕化展开进一步的研究，关键在于能否培养出HTF，并对该细胞的经过多代繁殖后细胞活力与增值能力是否依然稳定进行深入了解，进而为有效的开展泡瘢痕的形成机制研究提供数据参考。

1 资料与方法

1.1 样本来源

选择眼科门诊部收治的白内障手术患者中6例，所取的Tenon囊组织，其中男性患者和女性患者各3例，年龄分布为37～75岁，患者平均年龄为65岁。每位患者手术中所取组织都为4mm×6mm，厚度为1mm左右。对于手术中所取材料全部进行单独培养HTF，n=6。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

采用医学报道资料中的组织贴块法对所选细胞原进行单独代培养。将人Tenon囊组织放置在DMEM培养液当中，将结缔组织与血迹采用直镊分离法完全分离开，随后把Tenon囊组织剪切成规格为1mm× 1mm左右的组织块，并将剪切好的组织块放置于培养皿（Coring Ltd）里面，然后在培养皿中放入DMEM培养液（含20%胎牛血清），开始完成贴壁培养。观察细胞成长，当细胞变为融合状态后，采用0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）消化、传代至75mL培养瓶（Corning Ltd）[2]。

1.2.2 标本的制备

实验选择第5～9代细胞，将所选细胞放置于培养皿中，进行贴壁培养，等待细胞成长至70%～80%的亚融合状态后，将细胞放置于3mLDMEM培养液中观察48h。然后将部分培养皿中的DMEM培养液吸弃，最终浓度依次为：0μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/ L的TGF-β1实行24h诱导；将剩余部分培养皿根据诱导进行重新分组，最终浓度为10μg/L的TGF-β1诱导时间分别为24h、48h、72h。对照组细胞全部实行贴壁培养达待细胞成长至70%～80%亚融合状态后，放置于培养皿中静置48h。

1.2.3 细胞表型转化鉴定

采用免疫细胞的化学技术对细胞进行技术鉴定，对于所有诱导完成后的HTF悬液以及阳性对照人选取的平滑肌细胞进行鉴定，一抗选用鼠抗α-SMA单克隆抗体比例为1∶100，空白对照组未采用一抗；二抗则选择碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG比例为1∶200；采用TBS 1∶50稀释之后，NBT/BCP染色试剂盒出现颜色，采用常规型透明脱水；使用中性树脂封片进行保存[3]。

2 结 果

2.1 细胞培养情况

对所选人Tenon囊组织块进行5～7d的贴壁培养后，观察细胞有梭形HTF长出，再经过1∶2的传代增值后，大约3～4d后培养器皿整个瓶底便会长满，大约5d时间HTF可实现汇合状态。

2.2 细胞表型鉴定

经过免疫细胞的化学技术检测后观察到：α-SMA在与阳性对照hVSMC后出现了深紫红色阳性染色。而免疫组细胞在未加一抗时，HTF对照为阴性，没有着色。将HTF放置24h之后（TGF-β1为0μg/ L）也没有着色反应，即为阴性。采用浓度分别为2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L TGF-β1对HTF进行诱导24h之后，α-SMA出现了紫红色着色现象，变现为阳性。

3 讨 论

目前临床上治疗青光眼主要采用滤过手术，然而虑过手术的失败率高达15%～25%，经过医学研究分析得知，滤过泡瘢痕化是造成滤过手术失败的主要原因，而Tenon囊成纤维细胞在滤过泡瘢痕化的形成中起到了关键性作用，因此研究人Tenon's囊成纤维细胞的培养和鉴定具有重要意义。经分析，目前国内外医学实验中所使用的HTF大部分都是通过组织块法对原代进行再培养后取得的。成纤维细胞获得的倍增时间相对来说较短，分化潜力很强，体外增值迅速，对于抗滤过泡纤维化进行科学研究时多选择将HTF作为靶细胞，目的在于通过抑制细胞实现对滤过泡瘢痕化产生抑制作用。本研究证实，通过对原代培养HTF进行多次传代后，发现原第3～5代细胞具有较强的活力，并且传代后的细胞增殖能力比较稳定，可作为医学界开展滤过泡抗纤维化研究的优良靶细胞。

[1]陆燕,魏锐利,蔡季平,等.甲状腺相关性眼病眼外肌来源成纤维细胞的原代培养和鉴定[J].眼科新进展,2011,31(5):91-92.

[2]肖莉,苏敏,石清明.兔角膜缘干细胞体外培 养方 法的研 究[J].西 南国防医药,2010,20(3):121-122.

[3]赵杰,蔡可丽.雷帕霉素对培养的人Tenon's囊成纤维细胞的作用[J].山东大学学报(医学版),2007,45(6):55-56.

R775

：B

：1671-8194（2013）09-0087-02

深圳市科技计划项目（项目编号201002132）；广东省自然科学基金项目（项目编号S2012040006423）