温扬敏 ，邱丹缨，罗彩林，谢永华

1泉州医学高等专科学校细胞生物学与医学遗传学教研室;2泉州医学高等专科学校基础医学部，福建 泉州362011

海洋贝类含有丰富的营养物质，是新型的创新药物和功能性食品资源［1］。贝类多糖是存在于贝类体内的一种生物活性物质，其结构和功能非常复杂。贝类多糖药理作用与植物多糖相似，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老以及增强免疫等作用［2-4］。象拔蚌(Panope generosa)，属软体动物，双壳纲，海螂目，海螂属，是远东包括华人及日本人崇尚食用的高级海鲜，原产地在美国和加拿大北太平洋沿海。十九世纪九十年代，被引入中国开始人工养殖［5，6］。研究象拔蚌多糖的提取工艺以及抗氧化活性，对新型功能食品的开发以及象拔蚌活性物质的利用具有重要的理论和实践价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

象拔蚌:购自福建泉州洛江农贸市场。羟自由基测定试剂盒和总抗氧化试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。定性滤纸(whatman NO1001-110)，氯仿(AR，天津市化学试剂一厂)，正丁醇(AR，天津市登科化学试剂有限公司)，蒽酮(AR，上海邦成化工有限公司)，葡萄糖(AR，北京冬歌生物科技有限公司)，维生素C(阿特维斯(佛山)制药有限公司，批准文号H44021227)，无水乙醇(西陇化工股份公司)，硫酸(西陇化工股份公司)。

1.2 实验仪器与设备

分光光度计:SP-752 紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。超声波清洗机:VGT-1620QTD 型，深圳市兴宏业投资有限公司。高速冷冻离心机:KDC-160HR，科大创新股份有限公司中佳分公司，冷冻干燥机:FD-1C-50，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同超声时间对象拔蚌多糖提取工艺影响

选择壳长6～10 cm 新鲜象拔蚌成贝，去壳、洗净、称取其肌肉30 g，放入500 mL 烧杯，再加入固液比(g/mL)为1∶10 的双蒸水。放置于超声波清洗机(40 KHz，100 W)，分别于50 ℃水浴超声波处理10、20、30、40、50 min，每组实验设3 个平行。再用定性滤纸过滤，取滤液Sevag 法除蛋白。加入乙醇使最终乙醇浓度为80%，4 ℃过夜沉淀。6000 g 离心15 min 收集多糖，冷冻干燥［7］。

1.3.2 不同超声温度对象拔蚌多糖提取工艺的影响

称取象拔蚌肌肉30 g，放入500 ml 烧杯，再加入固液比(g/mL)为1∶10 的双蒸水。放置于超声波清洗机(40 KHz，100 W)，分别于30、40、50、60、70℃水浴超声波处理30 min，每组实验设3 个平行。多糖提取同1.2.1。

1.3.3 不同固液比对象拔蚌多糖提取工艺的影响

称取象拔蚌肌肉30 g，放入500 ml 烧杯，分别加入固液比(g/mL)为1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15 的双蒸水。放置于超声波清洗机(40 KHz，100 W)，于60 ℃水浴超声波处理30 min，每组实验设3 个平行。多糖提取同1.2.1。

1.3.4 正交试验优化象拔蚌多糖提取工艺

根据单因素实验结果，设计超声温度(50、60、70 ℃)、时间(20、30、40 min)和固液比(1∶6、1∶9、1∶12)三因素三水平正交实验优化象拔蚌多糖提取工艺，每组实验设3 个平行。多糖提取同1.2.1。

1.3.5 多糖测定

采用蒽酮比色法［8］测定多糖含量。标准曲线方程:y =0.4027x-0.0113，R2=0.9997。象拔蚌多糖提取率(%)=(象拔蚌多糖质量/象拔蚌肌肉质量)* 100%。

1.3.6 拔蚌多糖抗氧化活性测定

总抗氧化能力(T-AOC)检测和羟自由基测定均严格按照南京建成生物工程研究所羟自由基测定试剂盒说明书操作。T-AOC 单位定义:在37 ℃时，每mL 多糖溶液每分钟使反应体系的吸光度(OD)值，每增加0.01 时，为一个总抗氧化能力单位(U)。羟自由基抑制活性定义:规定在37 ℃下反应一分钟，每mL 多糖溶液使反应体系中的H2O2浓度降低1 mmol/L 为一个抑制羟自由基能力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 不同超声时间对象拔蚌多糖提取率的影响

图1 超声时间对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

超声温度对象拔蚌多糖提取率的影响见图1。从图1 可以看出当超声波处理时间小于30 min 时，象拔蚌多糖提取率随着超声时间延长而增加，而当超声时间大于30 min 时，多糖的提取率随时间延长反而有所下降。当超声波处理30 min 时象拔蚌多糖提取率最高，与超声波处理时间小于10 min 比较存在极显著差异(P ＜0.01)。其原因可能是超声处理时间较短时，随着时间增加有利于多糖的溶解。然而当超声波处理时间过长，可能导致一些物质降解［9］。

2.2 不同温度对象拔蚌多糖提取率的影响

图2 超声温度对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polysaccharides

超声温度对象拔蚌多糖提取率的影响见图2。从图2 可以看出，象拔蚌多糖提取率随超声温度升高而逐渐增加，但随着温度进一步升高，象拔蚌多糖的提取率趋于平稳。与超声温度30 ℃比较，当温度为60 和70 ℃时，象拔蚌多糖提取率均存在显著差异(P ＜0.05)。超声温度为60 ℃时，象拔蚌多糖提取率最大，比超声温度为30 ℃时提高36.53%。其原因可能是随着超声温度升高，能降低液体的黏度、增加接触表面积、加速质量传递和空化作用等［10］。

2.3 固液比对象拔蚌多糖提取率的影响

图3 固液比对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

不同固液比对象拔蚌多糖提取率的影响见图3，从图3 可以看出，当固液比小于1∶9 时，随着加水量增加象拔蚌多糖的提取率迅速增高。但当固液比大于1∶9 时，继续增加水量，象拔蚌多糖提取率趋于稳定。其原因可能是增加水量有利于多糖物质的溶解。但当加水量达到一定程度时，多糖已全部溶解，所以继续增加水量多糖提取率不再增加。考虑到固液比大，会给后续工序带来困难，消耗较多热能，且长时间浓缩也会破坏多糖，综合各方面考虑，适宜的固液比为1∶9。

2.4 正交实验优化象拔蚌多糖提取工艺

表1 象拔蚌多糖提取的正交实验Table 1 Orthogonal experiment of extracting polysaccharides from Panope generosa

注:实验数据为三次试验结果平均值

一方面，适宜条件的超声处理能减小样品颗粒大小和加速了样品内部水分子扩散，且对样品内部水分扩散系数的影响随着超声强度的增加而逐渐增强，从而提高多糖提取率。但另一反面，超声波也可导致多糖分解［9，10］。所以确定多糖提取的超声条件显得至关重要。三因素三水平正交实验优化象拔蚌多糖提取实验结果见表1，从表1 可以看出影响多糖提取的首要因素是加水量，其次是超声时间和超声温度(C ＞B ＞A)。根据方差分析(表2)，固液比对象拔蚌多糖提取率影响显著(P ＜0.05)，而温度和时间对象拔蚌多糖提取率有一定影响，但影响不显著(0.10 ＞P ＞0.05)。象拔蚌多糖提取最佳工艺是超声温度60 ℃、超声时间30 min、固液比为1∶12(A2B2C3)。

表2 象拔蚌多糖提取的正交实验方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment of extracting polysaccharides from Panope generosa

2.5 象拔蚌多糖总抗氧化活性测定

图4 多糖的总抗氧化活性Fig.4 Total antioxidant activity of polysaccharides

抗氧化剂和抗氧化酶是人体本身能不断产生的防御自由基损害的物质。有些抗氧化剂可以达到防御疾病、延缓衰老的目的。不同浓度的象拔蚌多糖总抗氧化活性见图4。从图4 可以看出，象拔蚌多糖的总抗氧化活性随浓度升高而增加。象拔蚌总抗氧化活性与多糖浓度有明显的量效关系。当浓度低于0.05 mg/mL 时，象拔蚌多糖总抗氧化活性高于Vc，而随着浓度增加，Vc 总抗氧化活性明显高于象拔蚌多糖。

2.6 象拔蚌多糖清除自由基活性测定

图5 多糖的羟自由基清除活性Fig.5 Capability to scavenge hydroxyl radicals of polysaccharides

羟自由基(·OH)是已知活性氧中对生物体毒性最强的一种自由基，过多羟自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜等。从天然产物中分离无毒、高效的清除羟自由基活性物质，并将其应用于医药、食品、化妆品等领域有重要现实意义［9］。从图5 可以看出，在低浓度时，象拔蚌多糖清除羟自由基能力明显低于Vc。但随着浓度增加，象拔蚌多糖清除自由基能力显著升高，当浓度增加到4 mg/mL 时，象拔蚌多糖清除自由基能力大于Vc。象拔蚌多糖羟自由基清除活性和浓度之间关系可用公式表示为:y =0.161x+0.431(R2=0.887)。

3 讨论

超声波作为一种特殊的能量形式，在液体中传播时可以产生空化效应、机械效应和热效应等。作为一种新技术在中草药有效成分的提取、药物制剂工艺的改进、药物的合成与降解、以及在生物药剂等方面的运用中倍受青睐［11］。近年来，超声波已广泛应用于不同植物多糖［9］和贝类多糖的提取［12］。超声辅助法能提高生物多糖的提取效率，其机制主要包括两个方面:一方面超声波能加速细胞破碎，另一方面超声波能加速细胞内物质溶解速度［10］。

Denham Harman 衰老的自由基学说，认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。机体的组织细胞不断产生的自由基积累结果，可使细胞中的多种物质发生氧化，损害生物膜。还能够使蛋白质、核酸等大分子交联，影响其正常功能［13，14］。天然抗氧化活性物质被人体吸收后，有的作为体内抗氧化酶类的诱导剂，提高体内相关抗氧化酶类水平，有的能直接清除自由基。天然抗氧化活性物质不仅能延缓衰老，还可通过增强机体免疫能力而达到抑制和消除肿瘤的功效。从海洋贝类获取高效、价廉、低毒甚至无毒的天然抗氧化剂已取得重要进展［15，16］。本研究表明，不同浓度象拔蚌多糖均具体羟自由基清除能力和抗氧化活性，说明象拔蚌多糖还可能具有抗肿瘤活性。有关象拔蚌提取物的抗肿瘤活性，以及通过提高机体免疫能力和抗肿瘤关系有待进一步研究。

1 Adachi Y，Okazaki M，Ohno N，et al. Enhancement of cytokine production by macrophages stimulated with (1-3)-beta-D-glucan，grifolan (GRN)，isolated from Grifola frondosa.Biol Pharm Bull.1994，12:1554-60.

2 Woo ER，Kim WS，Kim YS. Virus-cell fusion inhibitory activity for the polysaccharides from various Korean edible clams.Archives Pharm Res，2011，6:514-517.

3 Li Z，Wan SL，Bao QH，et al.Isolation and characterization of antitumor polysaccharides from the marine mollusk Ruditapes philippinarum.Eur Food Res Tech，2008，1:103-110.

4 Zhan XD(湛孝东)，Wang KX(王克霞)，Li CP(李朝品).Advances on biological activities of Polysaccharides from shellfish.Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2006，7:1285-1286.

5 Nielsen JK，Nielsen JK.Geoducks(Panopea abrupta)as isotopic bioarchives of seasonality in the climate of British Columbia.Biomed Life Sci，2009，5:987-995.

6 Zhang L(张良)，Ma GL(马广良). The artificial rearing technique of Panopea abrupta.China Fisheries(中国水产)，2003，9:60-61.

7 Hong Ye，Keqi Wang，Chunhong Zhou，et al.Purification，antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharidesfrom the brown seaweed Sargassum pallidum. Food chemistry，2008，111:428-432.

8 Huang JH(黄建华)，Yuan DQ(袁道强). Biochemical Experiments(生 物化 学 实 验). Beijing:Chemical Industry Press，2009.159-162.

9 Bao Y，Zhao MM，Shi J，et al. Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp. Food chemistry，2008，2:685-690.

10 Mircea Vinatoru. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs. Ultrasonics Sonochemistry，2001，3:303-313.

11 Chang MQ(常明泉)，Peng XY(彭小燕)，Chen XZ(陈学珍)，et al. Application of ultrasonic technology in development and research of medicament.Chin pharm Affairs，2009，12，1221-1223.

12 Chen M(陈檬)，Li HS(李和生).Technology for extracting amino acid from oyster with ultrasonic wave.Food Sci Tech，2006，312:41-43.

13 Denham Harman. Free radical theory of aging. Mutation Research/DNAging，1992，3:257-266.

14 Leanderson P，Faresjo AO，Tagesson C. Green tea polyphenols inhibits oxidant-induced DNA stand breakage in cultured lung cells.Free Radic Biol Med，1997，23:235-242.

15 Wen YM(温扬敏)，Luo CL(罗彩林)，Chen SZ(陈淑增).Influence of extract from Coelomactra antiquata on antioxidant ability of normal mice.Sci Tech Food Ind，2011，5:371-372.

16 Cheng SW(程仕伟)，Yu XM(于晓明)，Zhang YX(张玉香).Study on extraction of polysaccharides from Mytilus edulis and their antioxidant activity in vitro.Sci Tech Food Ind，2010，9:132-134.