连国琦，周笑犁，孔祥峰 ，冯泽猛，印遇龙

1中国科学院亚热带农业生态研究所，中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室，长沙410125;2南昌大学生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047;3 中国科学院环江喀斯特农业生态试验站，环江547100;4 中国科学院研究生院，北京100039

自20 世纪50 年代报道在饲料中添加抗生素具有促生长效果以来，抗生素便被作为促生长剂而被广泛用于饲料添加剂。抗生素的长期使用在促进动物生长和提高畜产品产量的同时，也带来了严重的负面效应，如抗生素在畜产品中的残留，滥用抗生素引起的内源感染、二重感染及耐药菌株的产生，这都会造成畜禽免疫功能的低下和畜产品品质的下降［1］。近年来，我国也不断发布有关抗生素和药物饲料添加剂方面的规章制度，逐步减少抗生素等药物的使用量和使用品种。壳聚糖是甲壳素的重要衍生物，是甲壳素脱乙酰度达到70%以上的产物，是除蛋白质以外含氮量最大的有机氮源，也是自然界中唯一的碱性多糖。但由于壳聚糖不溶于水，其开发应用受到很大限制［2］。壳寡糖(COS)学名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术处理而得到的一种全新产品，作为一种纯天然、无污染的物质，其资源丰富、生物活性高、无毒副作用，可被机体快速吸收，实际应用中问题较少，在医药、农业、食品等领域应用广泛，前景广阔［3］。本试验测定了COS 对断奶环江香猪营养物质代谢和肠道微生物的影响，旨在为开发绿色环保型饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物、饲养管理及分组

饲养试验于2009 年6 月在广西环江东兴镇某香猪养殖场进行。选用21 日龄断奶的环江香猪12头，随机分成2 组，每组6 头。按中国地方猪营养需要量［4］并结合NRC(1998)营养需要量［5］配制基础日粮。对照组在基础日粮中添加抗生素，试验组在基础日粮中添加0.5%的COS。日粮中加入2 倍水后，调成粥状饲喂。日喂3 次，自由采食和饮水。预试期按常规免疫程序对试猪进行驱虫、防疫。正试期为14 d，期间每日观察猪群的健康情况。

1.2 血浆生化参数测定

试验结束后，每头试猪前腔静脉采血10 mL，肝素抗凝，3000 rpm 离心10 min 分离血浆，用CX4 型全自动生化分析仪(Beckman 公司产品)测定血浆总蛋白、白蛋白、尿素氮、血氨、免疫球蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯和胆固醇的含量及碱性磷酸酶的活性。测定方法按照试剂盒(由北京利德曼公司提供)说明进行。

1.3 食糜采集与微生物DNA 提取

处死仔猪后，无菌收集回肠和盲肠内容物，液氮速冻后，-80 ℃保存。在提取DNA 前，样品于4 ℃解冻，取约3 g 湿重的粪样，移入50 mL 置于冰预冷的0.1%吐温-80 中，充分涡旋，均质化后，200 g 低速离心6 min 取上清，将上清12000 g 高速离心20 min弃上清，留沉淀。反复洗涤沉淀3 次至上清变澄清［6］。将提取的细菌分装至1.5 mL 离心管中-70℃保存。按TIANGEN 公司细菌基因组DNA 提取试剂盒的说明书提取肠道细菌基因组总DNA，采用NanoDrop® ND1000(NanoDrop Technologies Inc.，DE，USA)测定DNA 的浓度，并以OD260/OD280 评价DNA 的纯度。

1.4 肠道微生物的荧光定量PCR 分析

采用SYBR Green I 染料法，在荧光定量PCR 仪(ABI 7900HT)上进行扩增，并运用Applied Biosystem SDS2.3 进行定量PCR 数据分析。以最小Ct 值和最高荧光值为标准，分别对循环条件、退火温度、引物浓度进行优化。最后确定反应体系为20 μL:包括10 μL Takara SYBR Premix Ex Taq(2 ×，预混MgCl2、dNTP、SYBR Green I 染料、EX-Taq 聚合酶、buffer)，0.4 μL 引物(10 μM)，2 μL cDNA 模板，ddH2O 补充至20 μL。分别设计5 对引物(具体序列及产物见表1)，用于进行样品中双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Peptostreptococcus)、大肠杆菌(Escherichia)和总细菌基于16S rDNA 基因的相对定量。PCR 反应程序为:95 ℃，3 min;95 ℃30 s、60 ℃60 s、72 ℃30 s，40 个循环。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成引物。样品DNA 的检测采用3 个重复，取平均值。采用2-△△CT法［7］统计目的基因的相对表达量。

表1 实时定量PCR 相关引物Table 1 The primers of bacteria determined in real-time PCR

Lactobacillus Reverse - 5’-GAGCCTCAGCGTCAGTTG-3’大肠埃希菌 Forward- 5’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3’ 95 Escherichia Reverse - 5’-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3’链球菌 Forward - 5’-GATGGACCTGCGTTGTATTAGCT-3’ 277 Peptostreptococcus Reverse - 5’-CCCTTTCTGGTAAGATACCGTCAC-3’总细菌 Forward - 5’-CAGGATTAGATACCCTGGTAGT-3’ 146 Total bacteria Reverse - 5’-CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’

1.5 数据处理

数据经Excel 初步处理后，采用SPSS13.0 统计软件ANOVA 程序单因素方差分析对不同处理间数据进行显著性分析，以P ＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 COS 对环江香猪血浆生化参数的影响

由表2 可见，与对照组相比，COS 组碱性磷酸酶活性显著升高(P ＜0.05)，高密度脂蛋白、总蛋白和IgG 浓度均有增加趋势(P ＞0.05)，低密度脂蛋白、血氨、甘油三酯、胆固醇和尿素氮浓度均有下降趋势(P ＞0.05)。

表2 日粮添加壳寡糖对环江香猪血浆生化参数的影响(n=6)Table 2 Effect of dietary supplementing COS on plasma biochemical parameters in Huanjiang mini-piglets (n=6)

2.2 COS 对环江香猪肠道微生物的影响

使用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取其总DNA 后，测定OD260 和OD280 的吸光值，所提取总DNA 的OD260/OD280 比值均在1.8～2.1 之间，说明提取的DNA 无蛋白、RNA 和有机试剂的污染;对其进行PCR 扩增，结果表明，所有样品的扩增效率均较好，扩增片段长度均约为1500 bp(如图1 所示)。

图1 DNA-PCR 产物1%琼脂糖电泳代表性样图Fig.1 Representative PCR profile of bacterial genomic DNA

通过溶解曲线检测所用引物的特异性，发现每个样品的溶解曲线均相似，并没有额外的峰存在，说明可以排除非特异性扩增的影响。如图2 所示，双歧杆菌、乳酸杆菌、链球菌、大肠杆菌和总细菌16S rDNA 基因的扩增曲线均为单一的峰型，确认所用引物的特异性较高。

由表3 可见，与对照组相比，COS 组回肠乳酸杆菌数量显著增加、链球菌数量显著降低(P ＜0.05)，盲肠内双歧杆菌和乳酸杆菌数量显著增加、大肠杆菌和链球菌数量显著降低(P ＜0.05)。

图2 部分肠道细菌16S rDNA 基因的溶解曲线Fig.2 Dissociation curve of 16S rDNA fragments amplified from part of intestinal bacteria

表3 壳寡糖对环江香猪部分肠道细菌数量的影响(n=6)Table 3 Effects of dietary supplementing COS on part of intestinal bacteria in Huanjiang mini-piglets (n=6)

3 讨论

中国的小型品种猪资源丰富，如环江香猪、巴马香猪等。小型猪作为一种非啮齿类动物，其解剖学、生理学及营养代谢特性与人类极为相似，正逐步成为研究人类疾病的实验动物模型［8］。香猪是我国乃至世界稀有的特小型猪种，具有独特的种用价值，现已被农业部列为国家畜禽出口管理二级保护品种［9］。鉴于环江香猪的饲养管理仍较为粗放，导致日粮中营养成份不够全面，猪的生长发育较缓慢，若要大力发展香猪生产，首先要解决其饲料营养及安全问题。

关于COS 对动物生产性能的影响，国内外已进行了不少研究，但结果不尽一致［10，11］。在本试验中，添加COS 14 d 后，断奶仔猪的生长性能没有改善，可能与寡糖添加时间短有关，估计添加较长时间可能会有较好的饲料转化率。

血清中的碱性磷酸酶与脂肪、糖类和蛋白质的吸收、运输、合成等过程密切相关［12］。血液尿素氮是蛋白质代谢的终产物，其浓度受饲料中蛋白质含量与品质的影响［13］。该浓度主要反映氨基酸在动物体内的代谢情况，过量的氨基酸在体内进行脱氨基作用会增加血液尿素氮的浓度［14］;氨基酸平衡状况良好时，血液尿素氮浓度下降。本试验中，COS 组仔猪碱性磷酸酶活性显著升高、血浆尿素氮浓度降低，说明仔猪对日粮蛋白质的利用能力增强。总蛋白浓度的升高，也表明仔猪对日粮蛋白质的消化吸收作用加强，有助于组织蛋白质的合成。由上可见，COS 可提高断奶仔猪对日粮蛋白质的利用，有助于组织蛋白质的合成。周笑犁等也报道，在日粮中添加大豆寡糖可降低断奶环江香猪血氨和尿素氮水平，改善蛋白质代谢，还能提高机体中一些必需氨基酸的含量［15］。

动物肠道菌可分为有益菌与有害菌，二者存在生理性动态平衡。在微生态平衡状态下，动物肠道中的正常菌群对肠道的结构、功能和健康具有重要作用［16］。健康个体中双歧杆菌、乳酸杆菌等是正常优势菌群，细菌数可达1 ×1010～1 ×1011个/g;大肠杆菌和某些链球菌属于腐败性细菌，细菌数可达1×105～1 ×107个/g［17］。本试验结果表明，COS 对大肠杆菌、链球菌等肠道有害菌有明显的抑制作用，而对双歧杆菌和乳酸杆菌有明显的促进作用，这可能与不同肠道菌对低聚糖的利用情况不同有关。双歧杆菌能够很好地利用大多数功能性低聚糖，而腐败梭菌、产气夹膜梭菌等有害菌则几乎不能利用各种低聚糖［18］。也有资料表明，壳寡糖由于相对分子质量小，易于透过细菌胞膜进入细胞质和细胞核内，使其细胞内部起生物活性的相关酶发生泄露，同时与带负电荷的物质如DNA 相互作用，干扰DNA 的复制与转录，从而发挥其抗微生物活性［19］。乳酸菌和双歧杆菌在肠道内能形成正常菌群并产生短链脂肪酸，使肠道酸度增加，从而抑制肠道内不耐酸病原菌的繁殖，在动物肠道内还可产生细菌素、类细菌素、过氧化氢和某些有机酸等，并可黏附于肠道细胞上，产生占位性竞争和营养性竞争作用［20，21］。

综上所述，在日粮中添加COS 可以在一定程度上改善机体蛋白质代谢，并调控肠道微生态平衡，从而促进肠道健康。

1 Schwaber MJ，Venezia SN，Kaye KS，et al.Clinical and economic impact of bacteremia with extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Ch，2006，50:1257-1262.

2 Alberto DM，Michael S，Makarand VR. Chitosan:a versatile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering. Biomaterials，2005，26:5983-5990.

3 Jeon YJ，Park PJ，Kim SK.Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor.Carbohydr Polym，2001，44:71-76.

4 Ministry of Agriculture in China.Agricultural industry standards of the people’s republic of China NY/T65-2004. Pig feeding standards，2004.

5 NRC. Nutrient requirements of swine. 10thed. Washington，D.C.:National Academy Press，1998.

6 Yin FG(尹富贵)，Yin YL(印遇龙)，Kong XF(孔祥峰)，et al.Effect of acanthopanax senticosus extracts on gut microflora in early-weaned piglets.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2007，19:545-549.

7 Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 CT method.Methods，2001，25:402-408.

8 Van der Laan JW，J Brightwell，P McAnulty，et al.Regulatory acceptability of the minipig in the development of pharmaceuticals，chemicals and other products.J Pharmacol Toxicol Methods，2010，62:184-195.

9 Liu HJ(刘合军)，Yin YL(印遇龙)，Kong XF(孔祥峰)，et al.Effects of chinese herbal formula as a dietary additive on gut microflora in early-weaned piglets. Jiangsu J Agric Sci(江苏农业学报)，2008，24:53-58.

10 Li XJ(李晓晶)，Pu XS(朴香淑)，Yuan SL(袁书林)，et al.Effect of chitooligosaccharide substitute for aureomycin on growth performance and immune function in broilers.Feed ＆Husb:New Feed(饲料与畜牧:新饲料)，2007，(1):16-18.

11 You JM(游金明)，Qu MR(瞿明仁)，Wang ZR(王自蕊)，et al.Contrast effects of chito-oligosaccharide and chlortetracycline on growth performance in broilers. Acta Agric Jiangxi(江西农业大学学报)，2008，30:94-98.

12 Hua J(滑静)，Cao YC(曹永春)，Wan SX(万善霞)，et al.Effect of IgG on serum alkaline phosphatase activity and weaning growth in piglets.Beijing J Agric Colle(北京农学院学报)，2003，18:115-116.

13 Gomez GG，Phillips O，Goforth RA.Effect of immunoglobulin source on survival，growth and hematological and immunological variables in pigs.J Anim Sci，1998，76:1-7.

14 Liu HJ(刘合军)，Kong XF(孔祥峰)，Yin FG(尹富贵)，et al.Effects of acanthopanacissenticosi extract as dietary additive on growth performance and serum biochemical parameters in early-weaned piglets.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2006，18:993-998.

15 Zhou XL(周笑犁)，Fu DZ(傅德智)，Kong XF(孔祥峰)，et al.Effects of soybean oligosaccharides on growth performance and nutrient metabolism in weanling Huanjiang minipigs.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2012，24:98-101.

16 Mackie RI，Sghir A，Gaskins HR.Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract.Am J Clin Nutr，1999，69:1035-1045.

17 Sheng QK(盛清凯)，Yao HY(姚惠源). The regulatory mechanisms of oligosaccharides to intestinal flora. Anim Sci Anim Med(动物科学与动物医学)，2002，(2):35-38.

18 Liu HM(刘明河)，Wu QH(吴清华).Determination of chitooligosaccharides antimicrobial property. Biotech(生 物 技术)，2005，36(3):36-38.

19 Geminer M，Kneifel W，Kulbe KD，et al.Influence of a symbiotic mixture consisting of lactobacillus acideophilus 74-2 and a fructooligosaccharide preparation on the microbial ecology sustained in a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.Appl Microb biotech，2000，53:219-223.

20 Huang CH(黄沧海)，Qiao SY(谯仕彦)，Li DF(李德发)，et al.Research of probiotic Lactobacillus restrain Escherichia coli.Chin J Anim Sci(中国畜牧杂志)，2003，39(6):27-28.

21 Van der Werf MJ，Venima K. Bifidobacteria:genetic modification and the study of their role in the colon. J Agric Food Chem，2001，49:378-383.