王方杰，刘 韶* ，袁干军

1中南大学湘雅医院药剂科，长沙410008;2 中南大学湘雅药学院，长沙410013;

3江西农业大学生物科学与工程学院，南昌330045

迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)系唇形科常绿小灌木，原产于地中海地区，主产于西班牙、摩洛哥、前南斯拉夫、保加利亚和突尼斯。近年来，我国南方地区也广为栽种。迷迭香叶中富含挥发油，已广泛用于食用香料、食品、日用化工和医药产品等领域，在医药方面，迷迭香精油对神经衰弱、低血压和肌肉疼痛有较好疗效，具有一定的抗菌作用［1］和抗氧化活性［2］，还可能成为一种新的高效的抗癌药物［3，4］。近年来国内外对迷迭香精油成分的研究较多，已有报道［5-7］用气质联用法测定迷迭香挥发性成分，并结合商业质谱库鉴定了其中含量高的、能基线分离的化合物。但由于迷迭香精油中含有一些性质相近的组分，通过色谱条件优化后，仍存在重叠色谱峰，尤其是含量低的峰常常跟含量高的组分一起流出，难以准确鉴别和定量。在植物药的筛选过程中，出现了许多含量低的化合物具有高生理活性或高毒性的实例，因而对迷迭香精油进行准确定性、定量分析有助于其开发利用。直观推导式演进特征投影法(HELP)(Heuristic Evolving Latent Projections，HELP)［8］是一种对二维色谱/光谱矩阵数据进行解析的有效方法，已成功应用于对芫荽［9］、千斤拔［10］、桂花［11］、红薯叶［12］等挥发油的分析。本实验通过水蒸气蒸馏法提取迷迭香中的挥发油成分，采用HELP 法解析GC-MS 二维数据，得到各组分的纯色谱曲线和质谱，通过质谱库检索对分辨的组分进行定性，采用总体积积分法进行定量，准确定性的47个化合物占总含量的99.79%。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890A-5975C 气相色谱质谱联用仪，G3172A 质谱工作站，NIST08 质谱数据库(美国安捷伦公司);正己烷(国药集团化学试剂有限公司)、无水硫酸钠均为分析纯。

1.2 挥发油的提取

迷迭香叶(产于广西西林县)粉碎成粗粉，取2000 g 迷迭香粗粉，采用水蒸气蒸馏提取，得油水混合物2000 mL，用分液漏斗进行油水分离，上层加入2 g 无水硫酸钠用力振摇后，静置脱水1 h，用移液枪吸取液体部分，得迷迭香精油23 mL，低温保存，分析时用正己烷稀释50 倍。

1.3 气相色谱-质谱条件

色谱条件:HP-5MS 石英毛细管柱(30 m ×0.25 μm×0. 25 mm);载气为高纯氦气;流速为1 mL/min;进样口温度270 ℃;程序升温:初始柱温50 ℃，保持1 min，以3 ℃/min 速率升至250 ℃，保持20 min;分流比为50∶1;溶剂延迟4 min;进样量1 μL(以正己烷稀释50 倍)。

质谱条件:标准EI 源;离子源温度:230 ℃;四级杆温度:150 ℃;电子能量:70 eV;辅助接口温度:280 ℃;扫描范围:20～500 amu。

1.4 数据分析

采用安捷伦质谱工作站，检索NIST08 质谱库，对各个色谱峰进行结构确定;对于部分未完全分离的色谱峰，则使用化学计量学分析方法-直观推导式演进特征投影法(Heuristic Evolving Latent Projections，HELP)进行解析和比较分析，得到纯色谱峰和纯质谱峰后，再与质谱库对照定性。采用总体积积分法和归一法确定各化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 HELP 方法

2.2 迷迭香挥发油成分的定性分析

迷迭香挥发性化学成分的GC-MS 总离子流图见图1。GC 图约有40 个色谱峰，尽管不断优化色谱条件，仍有部分色谱峰发生重叠，一些看似纯峰的色谱峰也是由混合组分重叠而成。若采用MS 库直接检索，定性结果就会不准确，或色谱峰中匹配度较低的峰无法鉴别。挥发油定性分析主要采用G3172A 质谱工作站检索NIST08 质谱库进行谱图分析，对各个色谱峰进行结构确定;对于部分未完全分离的色谱峰，则使用HELP 法进行解析。

图1 迷迭香挥发油的总离子流图Fig.1 Total ion chromatography of the essential oil of rosemary

以保留时间段16.20～16.65 min 的峰簇A 与时间段11.25～11.60 min 的峰簇B 为例加以说明。图2 为峰簇A 与峰簇B 的总离子流图，峰簇A 看似为2 个典型的纯色谱峰。若直接从质谱库中检索，只能检测到2 个组分，且该峰簇后半部分不同位置质谱变化很大，检索结果与被测质谱相似度很低，不同位置检索结果也不相同。其中一个为bicyclo［2.2. 1］heptan-2-ol-2，3，3-trimethyl-，相似度仅为64%。峰簇B 为两组份的重叠峰，若直接从质谱库中检索发现前半部分质谱变化较大，检索结果匹配度也较低。色谱峰的定性难以实现，同时由于色谱峰重叠，难以进行定量分析。

图2 峰簇A 和峰簇B 的GC-MS 总离子流图Fig.2 Total ion chromatography of peak cluster A and peak

首先用HELP［13，14］法解析峰簇A，先进行背景扣除，得到该峰的秩图(见图3)。秩图是化学组分在保留时间方向上的一种组分分布信息图，能清楚显示组分随保留时间的变化情况。从图3 中可知，该色谱峰含有3 种成分，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别代表三个不同的组分;Ⅰ+Ⅱ、Ⅱ+Ⅲ分别代表组分1 和2、2 和3 的重叠区。再根据确定的组分数、各组分的选择性区域和零组分区域进行分辨，即得到这三种组分的纯色谱曲线和MS 唯一解，再在MS 库中对组分进行相似性检索，可知3 种组分分别是:樟脑，匹配度为98;5-甲基-2-异烯丙基环己醇，匹配度为95;2，3，3-三甲基二环［2.2.1］-2-庚醇，匹配度为94。HELP法解析出的色谱图见图4，其相应的MS 见图5。

如上所示再用HELP 法解析峰簇B，背景扣除后得到该峰的秩图(图3)。从图3 可知，该峰含有2种成分，Ⅰ、Ⅱ分别代表2 种不同的组分;Ⅰ+Ⅱ代表组分4 和5 的重叠区。进行分辨后得到这2 种组分的纯色谱曲线和MS 唯一解，再在MS 库中对组分进行相似性检索，可知2 种组分分别是:1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-环己烯，匹配度为96;桉叶素，匹配度为95。HELP 法解析出的色谱图见图4，其相应的MS 见图6。

最后采用同样的方法对其它的峰簇进行解析，得到迷迭香挥发油的组分，结果见表1。

2.3 迷迭香挥发油成分的定量分析

采用总体积积分和归一化法得到各组分的定量分析结果(见表1)，迷迭香定性组分占总含量的99.79%。

表1 迷迭香挥发油的成分及相对含量Table 1 the constituents and relative contents in the essential oil of rosemary

26 14.99 小茴香醇Fenchol，exo- C10H18O 154 0.076 91 27 15.34 (1α，2β，5α)-2-甲基-5-(1-甲乙基)-二环［3.1.0］-2-己醇Bicyclo［3.1.0］hexan-2-ol，2-methyl-5-(1-methylethyl)-(1α，2β，5α) C10H18O 154 0.044 90 28 15.51 2，6-二甲基-3，5-庚二烯-2-醇3，5-Heptadien-2-ol-2，6-dimethyl- C9H16O 140 0.036 96 29 15.56 6-莰烯酮Camphenol，6- C10H16O 152 0.015 94 30 16.32 樟脑Camphor C10H16O 152 7.608 95 31 16.43 5-甲基-2-异烯丙基环己醇Cyclohexanol，5-methyl-2-(1-methylethyl)- C10H18O 154 0.237 96 32 16.52 2，3，3-三甲基-二环［2.2.1］-2-庚醇Bicyclo［2.2.1］heptan-2-ol-2，3，3-trimethyl- C10H18O 154 0.065 94 33 16.89 1R-(1α，2β，5α)-5-甲基-2-异烯丙基环己醇Cyclohexanol，5-methyl-2-(1-methylethyl)-，1R-(1α，2β，5α)- C10H18O 154 0.080 96 34 17.07 2，6，6-三甲基-二环［3.1.1］-3-庚酮Bicyclo［3.1.1］heptan-3-one，2，6，6-trimethyl- C10H16O 152 0.049 97 35 17.18 2(10)-蒎烯-3-酮2(10)-Pinen-3-one C10H14O 150 0.019 91 36 17.31 龙脑Borneol C10H18O 154 2.431 97 37 17.40 α-萜品醇p-Menth-1-en-8-ol C10H18O 154 0.216 90 38 17.68 (1α，2α，5α)-2，6，6-三甲基-二环［3.1.1］3-庚酮Bicyclo［3.1.1］heptan-3-one，2，6，6-trimethyl-，(1α，2α，5α)- C10H16O 152 0.041 95 39 17.84 4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-环己烯-1-醇3-Cyclohexen-1-ol，4-methyl-1-(1-methylethyl)- C10H18O 154 0.804 97 40 18.21 1a，2a-4-三甲基苯甲醇Benzenemethanol，1α，2α，4-trimethyl- C10H14O 150 0.036 95 41 18.25 隐品酮2-Cyclohexen-1-one，4-(1-methylethyl)- C9H14O 138 0.053 91 42 18.46 1α，2α，4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇3-Cyclohexene-1-methanol，1α，2α，4-trimethyl- C10H18O 154 1.117 91 43 18.73 桃金娘醇(-)-Myrtenol C10H16O 152 0.052 90 44 18.96 4-亚甲基-1-(1-甲乙基)二环［3.1.0］-3-乙酸己酯Bicyclo［3.1.0］hexan-3-ol，4-methylene-1-(1-methylethyl)-acetate C12H17O2 194 0.013 97 45 19.06 氯化龙脑Bornyl chloride C10H17CL 172 0.032 91 46 19.26 马鞭草烯酮D-Verbenone C10H14O 150 1.621 93 47 21.94 未知Unknown 0.066 48 22.71 乙酸龙脑酯Bornyl acetate C12H19O2 196 2.011 98 49 28.38 丁香烯Caryophyllene C15H24 204 1.426 99 50 29.78 α-丁香烯α-Caryophyllene C15H24 204 0.962 97 51 34.88 石竹烯氧化物Caryophillene oxide C15H24O 220 0.039 90 52 35.89 未知Unknown 0.023

3 讨论

迷迭香挥发油的总离子流图约有40 个色谱峰，部分色谱峰发生重叠，用MS 直接检索可鉴别出匹配度＞90 的化学成分34 个，其他化学成分相似度降低，无法鉴别。HELP 法对不能鉴别出的重叠色谱峰进行逐个解析，共鉴定出47 个化学成分。迷迭香精油中主要成分为α-蒎烯(44. 19%)、樟脑萜(13.80%)、樟脑(7.61%)、1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-环己烯(3.61%)、乙酸龙脑酯(2.01%)、龙脑(2.43%)，其相对含量之和达到73. 65%，其中蒎烯、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯等具有消炎镇痛、解热、抗菌的功效。实验结果表明化学计量法辅助GCMS 联用技术解析复杂体系如挥发油等二维数据中的重叠峰，是一种方便准确的方法，比单独使用GCMS 法更真实、全面地反映迷迭香中的挥发油成分。

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