徐 彦，刘 圆，吕露阳，张志锋

西南民族大学少数民族药物研究所，成都 610041

贝母，始载于《神农本草经》，列入中品，具有清热润肺、化痰止咳的功效，有“止咳圣药”之称，在我国应用与研究已有两千余年的历史。我国大约有60 种45 变种5 变型［1］，《中国药典》2010 版记载川贝母包括6 个基源，其中卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)，为常用川贝母的来源之一。近年来，有关川贝母质量评价研究日益增多，包括分类学鉴定、化学成分含量测定以及药效学的研究等［2-5］。然而，采用“一测多评”法(Quantitative Analysis of Multicomponents by Single marker，QAMS)，测定川贝母中的贝母乙素和贝母甲素还未见文献报道。

“一测多评”法是一种用于多成分质量控制的研究方法，目前已用于中药质量控制的研究，尤其对中药缺乏对照品的研究具有重要的意义［6］，该法也被2010 年版《中国药典》采纳。本研究应用“一测多评”法对卷叶贝母进行多指标质量控制研究，即以贝母乙素对照品为内标物，通过建立其与贝母甲素的相对校正因子(Relative correction factor，RCF)进行含量计算，以降低检测成本和时间，验证方法的实用性，为川贝母中其他生物碱的检测及其它基源川贝母类药材的质量控制研究提供参考。

1 仪器、试剂和材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪(Agilent，美国)，Waters2695 高效液相色谱仪(Waters，美国)，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD 检测器、工作站;Alltech-2000 ELSD 蒸发光散射检测器(Alltech，美国);Millipore Milli-Q 超纯水机(Millipore，美国);METTLER AE240 电子分析天平(梅特勒-托利多，德国);W201B 恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司)。乙腈、甲醇(色谱纯，Merck 公司)，乙醇等其他试剂均为分析纯。贝母乙素(Peiminine，批号:110751-200709)、贝母甲素(Peimine，批号:110750-200609)对照品均购自中国药品生物制品检定所(纯度＞98%)。本研究药材为卷叶贝母(F.cirrhosa)的鳞茎，采集于四川省康定县境内，经西南民族大学刘圆教授鉴定为卷叶贝母。

2 方法与结果

本研究首先对HPLC-ELSD 同时测定卷叶贝母中的贝母甲素和贝母乙素和进行了方法学考察，然后对一测多评法的耐用性和适用性进行了评价，最后对所收集的样品进行测定并比较外标法和一测多评法测定结果的差异。

2.1 方法学考察

2.1.1 HPLC-ELSD 系统适应性条件

以乙腈(A)– 0.08%三乙胺水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～13 min，20% A→30% A;13～20 min，30% A;20～55 min，30% A→60% A;55～65 min，60% A;65～70 min，60% A→95% A;流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，ELSD 检测:温度88 ℃，N2流速2.2 L/min。

2.1.2 对照品溶液的制备

分别取贝母甲素和贝母乙素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL 各含0.5 mg 和0.5 mg 的贮备溶液。临用前稀释，制成混合对照品溶液(贝母甲素0.15 mg/mL，贝母乙素0.2 mg/mL)。

2.1.3 供试品溶液的制备

称取5 g 卷叶贝母药材粉末(过40 目筛)，置圆底烧饼中，先用8 mL 氨水浸润1 h，然后加入100 mL 氯仿-甲醇(4∶1)混合溶剂，70 ℃水浴上加热4 h，滤渣用50 mL 混合溶剂洗涤，过滤，合并滤液，转移至蒸发皿中水浴蒸干，用甲醇溶解，定容至5 mL，摇匀即得母液(生药量1 g/mL)。在进行样品测定时，取母液2 mL 定容于10 mL，得浓度为0.2 g/mL溶液作为供试液。

2.1.4 线性关系的考察

分别吸取不同体积的贝母甲素和贝母乙素贮备溶液，甲醇溶解并稀释制成含贝母乙素和贝母甲素的5 个不同质量浓度的系列溶液。按上述色谱条件测定，以对照品的质量浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行回归处理，得贝母乙素的回归方程分别为y =1. 7387x + 5. 026 (r =0.9992)，线性范围0.4～6 μg;贝母甲素的回归方程分别为y =1.6949x + 4.8321 (r =0.9991)，线性范围0.3～4.5 μg。

2.1.5 精密度试验

取同一对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样6 次，根据贝母甲素和贝母乙素的色谱峰面积，计算其RSD 分别为1.7%和0.1%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验

取同一批次卷叶贝母样品粉末6 份，精密称定，按2.3 项下操作，在上述色谱条件下进样测定，测得贝母甲素和贝母乙素的平均质量分数分别为0.03%，0.03%，RSD 分别为1.2%和0.8%，结果表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

取同一批次的卷叶贝母样品粉末精密称定，按2.3 项下操作，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样分析，测得贝母乙素、贝母甲素色谱峰面积的RSD 分别为0.7%和0.4%，结果表明样品溶液在12 h 内稳定。

2.1.8 加样回收率试验

取已知质量分数的卷叶贝母样品粉末6 份，各约2.5 g，精密称定，分别按已知质量分数的80%、100%和120% 3 个水平加入贝母甲素和贝母乙素对照品，按2.3 项下操作，在上述色谱条件下进样测定，计算加样回收率，贝母乙素、贝母甲素的加样回收率分别为99.8%、97.2%，RSD 分别为1.1%和2.8%。

2.2 “一测多评”耐用性和系统适应性评价

2.2.1 色谱柱考察

取“2.1.4”项下制备的混合对照品溶液，进样20 μL，以贝母乙素为内标，计算贝母乙素对贝母甲素的相对校正因子，考察了Dikma Spursil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Extend C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Grace C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)等3 种色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表1。表明不同色谱柱所得到的校正因子基本一致。

2.2.2 校正因子重现性考察

取“2.1.4”项下制备的混合对照品溶液，进样20 μL，以贝母乙素为内标，计算贝母乙素对贝母甲素的相对校正因子RCF，RCF = fs/fi= (As/Cs)/(Ai/Ci)，其中As为内标s 峰面积，Cs为内标s 浓度，Ai为某待测成分对照品i 峰面积，Ci为某待测成分对照品i 浓度。本研究考察了Waters 2695 和Agilent 1200 两种高效液相色谱仪对相对校正因子的影响，结果见表1，表明在不同的液相色谱系统下所得到的相对校正因子基本一致。

2.2.3 待测色谱峰的定位

采用贝母甲素与贝母乙素内标的相对保留值(Relative retention time，RRT)作为色谱峰定位标准，RRT=Ts/Ti，Ts为内标s 保留时间，Ti为某待测成分i 保留时间。并考察了其在不同仪器和不同色谱柱上的重复性，结果表明相对保留值波动较小，RSD 2.8%，因而本研究选用相对保留值作为目标色谱峰的定位指标。并且在此色谱条件下各批贝母样品的色谱峰峰形较好，分离度高，因此在“一测多评”法的实际应用中，可参考药材典型色谱图，利用相对保留值定位，根据内标贝母乙素的保留时间，通过相对保留值，因而能够正确判断目标峰的准确峰位置。

2.3 样品测定

取4 批卷叶贝母样品粉末约0.2 g，精密称定，按2.1.3 项下制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液进样测定。分别采用外标法和一测多评法计算卷叶贝母中贝母甲素和贝母乙素的含量，结果见表2，图1。结果两种方法所得含量无显著性差异，由此说明“一测多评”法可用于卷叶贝母的多种生物碱类成分质量研究。

表1 贝母甲素的相对校正因子和保留值(n = 6)Table 1 Related correction factors and related retention time of Peimine (n = 6)

表2 外标法和QAMS 测定卷叶贝母中贝母甲素和贝母乙素的含量(n=3)Table 2 The results of Peiminine and Peimine in F.cirrhosa by external standard method and QAMS

图1 混合对照品(A)和川贝母样品(B)的HPLC-ELSDFig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed markers (A)and F.cirrhosa sample (B)

3 讨论

“一测多评”法是指在一定的线性范围，某一类化学成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比。在多指标(s，a，b，…，i，…)质量评价时，以药材(或成药)中某一典型有效成分作内标(s)，建立内标与其它待测成分(a，b，…，i，…)间的相对校正因子(RCF)进行计算的质量评价模式，该方法实现多成分质量控制，同时又能克服中药对照品较少，不易获得和检测成本高等困难，是传统指纹图谱对药材进行质量评价基础上的又一个里程碑。

川贝母，由于大多来自野生资源，其价格日益高涨，在市场上鱼目混珠的现象非常严重，因此，对川贝母的资源进行质量评价，一直是众多科研工作者致力于解决的问题。本研究以实地采集的川贝母中的卷叶贝母作为研究对象，意在正本清源，为其他基源的川贝母的含量测定提供一种可行的思路。

本研究选用了对不同的流动相以及流动相的比例进行了分析，考察了乙腈(A)-0.02%磷酸盐水溶液(B)为流动相、甲醇(A)-0. 02% 磷酸盐水溶液(B)等，最终乙腈(A)-0.08%三乙胺水溶液(B)为流动相，分离度高，峰形好。考察了不同品牌的色谱柱以及色谱系统对贝母甲素的相对校正因子的影响，结果实验得到的校正因子具有较高的可信度，系统差异较小，通过计算结果表明，采用一测多评法计算的贝母甲素的结果和外标法测得的结果没有显著性差异。表明一测多评法可以在对照品缺失的情况下，实现定量测定的要求，为贝母类药材的质量评价以及《中国药典》的修订提供依据。

1 Xie ZM(谢志民)，Wang MC (王敏春)，Lv RX (吕润霞).Herbological study for the beimu categorical chinese medicine on the original plants.Zhong yao cai (中药材)，2000，23:423-427.

2 Zhou JL，Li P，Li HJ，et al.Development and validation of a liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry method for relative and absolute quantification of steroidal alkaloids in Fritillaria species. J Chromatogr A，2008，1177:126-137.

3 Li HJ，Jiang Y，Li P. Characterizing distribution of steroidal alkaloids in Fritillaria spp.and related compound formulas by liquid chromatography-mass spectrometry combined with hierarchial cluster analysis.J Chromatogr A，2009，1216:2142-2149.

4 Zhou JL，Xin GZ，Shi ZQ，et al.Characterization and identification of steroidal alkaloids in Fritillaria species using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Chromatogr A，2010，1217:7109-7122.

5 Xu J，Guo P，Liu C，et al.Neuroprotective kaurane diterpenes from Fritillaria ebeiensi.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75:1386-1388.

6 Yin M(尹萌)，Meng YL(孟月兰)，Wen LM(闻琍敏).Quantitative analysis of multi-components with single marker for determination of alkaloids in Phellodendri Amurensis Cortex.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2011，42:1093-1096.