刘进忠，张 沛

郑州大学第四附属医院口腔病理科 郑州450052

△男，1967年12月生，博士，副主任医师，研究方向:口腔癌的早期诊断，E-mail:Liujz@zzu.edu.cn

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)为世界五大常见肿瘤之一［1］，在口腔颌面部恶性肿瘤中最为常见，占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上［2］。随着治疗水平的不断提高，OSCC 的预后已有了极大的改善，但OSCC 的早期诊断及远期疗效仍不理想，预后较差，5 a 生存率仅50%左右［3-4］。作者应用免疫组化SP 法检测大鼠正常口腔黏膜到OSCC 发生及演变组织中EphA2、EphrinA1和E-cadherin 的表达，为OSCC 的癌前诊断及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 EphA2、E-cadherin 兔抗大鼠多克隆抗体购自北京博奥森生物制剂公司，EphrinAl 兔抗大鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz 生物技术公司，DAB 试剂盒和SP-9001 生物素标记山羊抗兔IgG 试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。70只雄性Wistar 大鼠购自河南省实验动物中心，大鼠为8 周龄，体质量约为200 g。

1.2 实验分组 取7 只作为正常对照(不处理)，余63 只为实验组，在口腔腭黏膜涂抹5 g/L 4NQO蒸馏水溶液，2 d 1 次，连续28 周。分别于处理4、8、12、16、20、24 和28 周随机抽取实验组9 只和对照组大鼠1 只，实验组取大鼠上腭部分病变黏膜组织(对照组取大致相同部位)，石蜡包埋。显微镜下观察，由两位有经验的病理医生协助做出病理学诊断和分级。大鼠上腭组织病理改变大致分为:7例正常黏膜，14例上皮单纯性增生黏膜，6例上皮轻度异常增生黏膜，10例上皮中度异常增生黏膜，19例上皮重度异常增生黏膜，14例鳞状细胞癌组织黏膜。

1.3 EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白的免疫组化检测 所有标本4 μm 厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水; 柠檬酸抗原修复; 体积分数3%H2O2去离子水封闭内源性过氧化物酶，在37℃温箱中孵育20 min; 滴加山羊血清50 μL/片，室温封闭内源性生物素20 min; 滴加适当比例的一抗(EphA2 和EphrinA1 按1 ∶ 100 稀 释，E-cadherin 按1∶ 200稀释)，37℃孵育3 h; 滴加二抗，50 μL/片，37℃孵育30 min; 滴加辣根酶标记卵霉链白素，50 μL/片，37℃孵育30 min; DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片。

1.4 免疫组化结果判定 EphA2 和EphrinA1 阳性染色定位于细胞质，呈散在或密集的棕黄色颗粒; E-cadherin 阳性染色定位于胞质或细胞核，以胞质染色为主，呈散在或密集的棕黄色颗粒。运用Biosens Digital Imaging System v1.6 图像分析系统(上海山富科学仪器有限公司)判断结果:在光学显微镜下每张切片选5 个视野(×100)，在同一光强度下测量阳性信号的平均光密度作为蛋白的表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据。不同大鼠口腔黏膜组织中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验，相关性分析运用Pearson 相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠不同病理类型口腔黏膜组织中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白的表达 EphA2 与EphrinA1 主要表达在口腔癌细胞和异常增生细胞中，在正常口腔黏膜细胞中不表达或微表达。Ecadherin 主要表达在正常口腔黏膜细胞，在口腔癌细胞中不表达或微表达。见图1、表1。

图1 大鼠不同病理类型口腔黏膜组织中EphA2(A)、EphrinA1(B)和E-cadherin(C)蛋白的表达(SP，×100)

表1 大鼠不同病理类型口腔黏膜组织中EphA2、EphrinA1 和E-cadherin 蛋白的表达

2.2 OSCC组织中EphA2、EphrinA1 与E-cadherin 蛋白表达的相关性分析 OSCC组织中EphA2 与EphrinA1 的表达呈正相关(r =0.708，P =0.015)，与E-cadherin 的表达呈负相关(r = － 0.531，P =0.004)，EphrinA1 与E-cadherin 的表达呈负相关(r= －0.596，P ＜0.001)。

3 讨论

酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase，RTK)作为跨膜传导某一细胞外信号的主要成分，在调控细胞生长、分化、存活以及迁移中起重要作用。Eph 受体是已知RTK 中最大的Ⅰ型跨膜糖蛋白家族成员，Eph 受体与其配体Ephrin 的相互作用可促进细胞间的连接与黏附，从而使它们正常地表达［5-6］。正常上皮细胞中，Eph 家族成员中EphA2 与其配体EphrinA1 相结合，发生自身磷酸化和降解，因此正常上皮细胞中EphA2 与其配体EphrinA1 低表达;而在肿瘤细胞中，由于EphA2 与其配体不能有效地结合，细胞间黏附力下降，使其在肿瘤细胞中堆积，不能降解，出现高表达［7］。

E-cadherin 是最主要的细胞间黏附分子，在上皮细胞中，E-cadherin 与EphA2 协同定位在细胞间连接位点，E-cadherin 参与调控EphA2 及其配体EphrinA1 的结合及后续降解，从而间接调控EphA2 的蛋白表达和功能转化［8-9］。因此，EphA2 与其配体EphrinA1 在肿瘤中表达上调的机制可能与E-cadherin 表达的下降有关［10］。

该研究结果显示，EphA2、EphrinA1 蛋白在正常组织中低表达，而随着口腔黏膜组织的恶行性转化，它们的表达水平也随之升高，尤其在OSCC组织中的表达水平最高，与上述研究［7］相符。而E-cadherin蛋白的表达随着OSCC 的发生呈下降趋势。

该研究结果还显示，OSCC组织中EphA2 与EphrinA1 蛋白的表达呈正相关，而二者均与E-cadherin 的表达负相关，这验证了E-cadherin 在EphA2与其配体EphrinA1 的结合与降解中起调节作用的理论机制。EphA2、EphrinA1 与E-cadherin 的表达具有密切关联性，可考虑将三者联合作为口腔癌恶性发展的监控指标，为早期诊断与治疗提供依据。

［1］Greenlee RT，Hill-Harmon MB，Murray T，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2001，51(1):15

［2］邱蔚六.口腔颌面外科学［M］.4 版.北京:人民卫生出版社，2000.

［3］Scully C，Bagan J.Oral squamous cell carcinoma overview［J］.Oral Oncology，2009，45(4/5):301

［4］史培荣.口腔鳞状细胞癌组织中STAT3 和CyclinD1 的表达及意义［D］.太原:山西医科大学，2010.

［5］van der Geer P，Hunter T，Lindberg RA.Receptor proteintyrosine kinases and their signal transduction pathways［J］.Annu Rev Cell Biol，1994，10:251

［6］Walker-Daniels J，Hess AR，Hendrix MJ，et al.Differential regulation of EphA2 in normal and malignant cells［J］.Am J Pathol，2003，162(4):1037

［7］Byrne RR，Shariat SF，Brown R，et al.E-cadherin immunostaining of bladder transitional cell carcinoma，carcinoma in situ and lymph node metastases with long term followup［J］.J Urol，2001，165(5):1473

［8］Abraham S，Knapp DW，Cheng L，et al.Expression of EphA2 and Ephrin A-1 in carcinoma of the urinary bladder［J］.Clin Cancer Res，2006，12(2):353

［9］Coffman KT，Hu M，Carles-Kinch K，et al.Differential EphA2 epitope display on normal versus malignant cells［J］.Cancer Res，2003，63(22):7907

［10］Orsulic S，Kemler R.Expression of Eph receptors and ephrins is differentially regulated by E-cadherin［J］.J Cell Sci，2000，113(Pt 10):1793