乔良普 （山东省临沂市河东区畜牧局 276034） 李丽 （临沂市科学技术合作与应用研究院）



狼尾草属牧草RAPD反应体系的建立与优化

乔良普 （山东省临沂市河东区畜牧局 276034） 李丽 （临沂市科学技术合作与应用研究院）

利用RAPD技术对狼尾草属牧草进行种质资源遗传多样性研究中，对影响PCR扩增效果的一些因素诸如DNA的提取浓度、Taq酶的选择及其用量、Mg2+浓度、dNTPs的用量以及退火温度等指标进行反复筛选和优化，结合正交试验的结果，最终确定RAPD-PCR的反应体系为：总体积20μl，反应体系中含有1.5μl (25mM)Mg2+、0.4μl(10mM)dNTPs、1.2μl(10pM)primer、0.4μl(5U/μl)Taq DNA Polymerase、2.0μl10×PCR Buffer、2.0μl DNA模板，ddH2O补足到20μl。

狼尾草属 RAPD 反应体系 优化

狼尾草属(Pennisetum Rich)牧草为一年生或多年生禾本科牧草，主要分布在热带和亚热带，全世界约有80种，多数原产于非洲[1]。目前我国人工栽培利用的种主要有多年生的象草(P.purpureum Schumach)和一年生的美洲狼尾草(P.americanum Rich.)及其种间杂交种。截止到2008年，经全国草品种审定委员会审定的狼尾草属品种共8种，其中引进福建省栽培种植面积较大的有5个品种依次为华南象草(P.purpureum cv. Huanan)、杂交狼尾(P.am-ericanum×P.purpureum)、热研4号王草(P.purpureum× P.americanurn.cv.ReyanNo.4)、桂牧1号杂交象草[(P.americanum×P.purpureum)×P.durpureum cv.Guimu No.1]和摩特矮像草(P.purpureum cv.Mott)。因其广泛的适应性、高产草量、高蛋白质含量及无融合生殖等特性，在发展草食动物生产中发挥了越来越重要的作用[2]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由Welsh and Mcclelland[3]和Williams[4]同时提出的一种DNA检测技术，是继RFLP技术之后发展起来的一种以PCR为基础的分子生物学技术。RAPD标记具有以下优点：所需基因组DNA用量少，而灵敏度高；实验易于操作，花费少；不必清楚与物种有关的基因组序列以及相关的分子生物学信息；具有通用性。目前，RAPD分子标记已经应用到了棉属[5]、石蒜属[6]、杜鹃属[7]、松毛虫属[8]、卷柏属[9]等植物。本文试图摸索适合狼尾草属牧草的RAPD反应体系，为以后其遗传多样性的研究提供理论依据及帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

材料选自福州狼尾草属牧草6个品系(粗茎象草、矮象草、细茎象草、紫象草、王草和台湾二系狼尾草)共12份材料，根据狼尾草属牧草的分布状况选取具有代表性的样本。要求每个样本的株间距至少在50m以上，每株采摘的鲜嫩叶片都做好标记，塑料袋低温保存，立即拿到实验室，进行基因组总DNA的提取。

1.2 主要试验设备与试剂

主要试验仪器设备有：PCR仪(美国Bio-RAD公司)、稳压电泳仪(北京六一仪器厂)、水平电泳槽(北京六一仪器厂)、凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)、低温离心机、紫外可见分光光度计、-80℃超低温冰箱、移液器(德国Eppendorf)等。试验所用的Taq DNA聚合酶、DNA Marker、引物等试剂均购自上海生工生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取及检测 采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生物有限公司)提取DNA，经0.8%琼脂糖凝胶检测及紫外分光光度计检测纯度和浓度，在凝胶成像分析系统上拍照，最后稀释成10ng/μl，放在-20℃冰箱中备用。

1.3.2 RAPD初始扩增体系及PCR扩增程序 初始的扩增反应体系为：总体积20μl，反应体系中含有1.5μl(25mM) Mg2+、0.4μl(10mM)dNTPs、1.2μl(10pM)primer、0.4μl (5U/μl) Taq DNA Polymerase、2.0μl10×PCR Buffer、2.0μl DNA模板，ddH2O补足到20μl。

初步设定的扩增程序为：95℃预变性5min，接下来94℃变性45s，50~60℃退火45s，72℃延伸60s共40个循环，72℃延伸7min，最后4℃保存。

1.3.3 RAPD-PCR扩增反应体系的优化 为了确保试验的稳定性和准确性，需要对RAPD反应体系进行摸索，本试验采用正交试验的方法，确定最终的反应体系。

就狼尾草属RAPD反应中的Taq DNA Polymerase的浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和引物浓度，选用选用L16(44)正交表，设计的PCR各成分的因素水平(表1)及正交试验设计表见表2。

表1 RAPD体系的因素水平

表2 PCR正交试验设计

以上16个处理，每个处理2次重复，共32个PCR管，按表2加样。反应体系总体积20μl，每管还包括1×PCR Buffer2.0μl和2μl的模板DNA。

1.3.4 PCR产物电泳检测 PCR产物经含EB1.4%琼脂糖凝胶电泳100V电压大约1h后，在美国Bio-Rad公司生产的型号GelDocXR凝胶成像系统上拍照。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取

使用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取的DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，拍照的图如1，从图可以看到提取的DNA整齐划一、明亮，且没有拖带产生。说明DNA提取的质量较好，没有DNA降解，也没有RNA及蛋白质污染，完全可以满足RAPD-PCR反应的需要。

图1 为狼尾草属牧草DNA 的凝胶电泳图

注:泳道1~6DNA分别为粗茎象草、矮象草、细茎象草、紫象草、王草和台湾二系狼尾草

图2 正交设计RAPD反应体系的扩增

注:1~16泳道为正交试验的16个处理

2.2 RAPD反应体系的确定

按照表2正交试验的设计，每管重复一次进行加样、PCR，将所得的产物凝胶电泳，结果如图2。从结果明显看出，随着dNTPs的增加，扩增产物明显变清晰，但其特异性差(1~3号)；而Taq DNA Polymerase浓度太低时，直接影响PCR扩增，甚至扩增很模糊，第11，14样本其特异性高，产物稳定可靠。再结合单因素试验结果，最终确定的20μl RAPD反应体系见表3：

表3 RAPD反应体系 (μl)

2.3 引物退火温度的筛选

根据正交试验的结果，选用第11号方案，对引物S228的退火温度进行选择，依据引物的Tm值，Tm±5℃生成10个梯度，如图3可见退火温度影响到PCR的特异性及产量，温度高，产物的特异性高。10个梯度均能扩增出条带，当温度低时，有些条带不明显，背景比较模糊；当温度在44℃时，引物与模板的特异性最高，且谱带清晰、多态性较高，当温度升高或降低时，条带减少且模糊。因此引物S228最佳的退火温度选择是44℃。当某一引物扩增出来的条带清晰明亮且多态性良好时保留，用做下一步试验。

图3 不同退火温度对扩增结果的影响

图4 12份狼尾草属牧草的RAPD扩增结果

2.4 RAPD反应体系的验证 经过优化最终确定的RAPD反应体系为：总体积20μl，反应体系中含1.5μl(25mM) Mg2+、0.4μl(10mM)dNTPs、1.2μl(10uM)primer、0.4μl Taq DNA Polymerase、2.0μl 10×PCR Buffer、2.0μl模板，ddH2O补足到20μl。反应程序：95℃预变性5min；4℃变性45s，36~45℃退火45s，72℃延伸60s，循环40次；72℃延伸7min；4℃保存。用引物S228对12份牧草进行扩增，结果如图4。从图上可以看到，扩增的条带清楚，位点明确，多态性高。

3 小结与讨论

3.1 DNA的提取是PCR反应的第一步 DNA提取的质量直接影响到后续反应的进行。本文用天根试剂盒提取的DNA纯度高，A260nm/A280nm值在1.8左右，没有RNA及蛋白质污染。DNA纯度高，且扩增出来的条带清晰明亮，多态率高，完全满足RAPD反应的需要。

PCR反应中的五大要素分别为引物、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+以及模板，PCR产物的特异性主要取决于引物与模板的匹配程度，每个PCR反应应该以最低的引物量产生所需的结果为好。引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且增加引物之间形成二聚体的机会。DNA聚合酶浓度过高可引起非特异性扩增，过低合成产物量减少。4种dNTP浓度要相等，任何一种浓度不同，就会引起错配。dNTPs浓度过低又会降低PCR产物的产量。Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，浓度过高，反应特异性降低，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。模板的浓度和纯度也是PCR成功与否的关键。如果PCR体系中的任何一个成分选择不合适就会使PCR结果变差甚至失败。PCR反应的程序也同样重要，其中退火温度、循环数、延伸时间、变性时间都会对PCR产物的产量和结果的特异性产生影响。

3.2 反应体系的建立 依据正交试验的结果，经过反复筛选优化的RAPD-PCR反应体系为：总体积20μl，反应体系中含有1.5μl(25mM)Mg2+、0.4μl(10mM)dNTPs、1.2μl (10pM)primer、0.4μl(5U/μl)Taq DNA Polymerase、2.0μl 10×PCR Buffer、2.0μl DNA模板，ddH2O补足到20μl。

[1] 林洁荣, 刘建昌. 福建南亚热带狼尾草属牧草品比试验[J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2003,32(1): 110-112.

[2] 卓坤水, 苏水金, 杜仲清等. 闽引象草(Pennisetum purpureum schum MIN-YIN)的选育[J]. 热带作物学报, 2009,30(8): 1196-1200.

[3] Welsh J,Mclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research, 1990,(18): 7213-7218.

[4] Williams J.G.K,Kubelik A.R.,Livak K.L,et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Research,1990,(18):6531-6535.

[5] 吴玉香. 棉属遗传多样性与栽培棉种间杂交研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2007.

[6] 袁菊红. 中国石蒜属(LycorisHerb.)种间亲缘关系与居群分子标记研究[D]. 南京农业大学, 2007.

[7] 周兰英. 杜鹃属植物亲缘关系及遗传多样性研究[D].四川农业大学, 2008.

[8] 南宫自艳. 松毛虫属部分种类遗传多样性及影响因素研究[D]. 河北农业大学, 2008.

[9] 万定荣. 湖北省卷柏属药用植物的鉴定和品质研究[D]. 湖北中医学院, 2006.

（2012–05–29）

S812.8

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1007-1733(2012)09-0007-03