张广斌 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）



潍坊地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌的分离鉴定

张广斌 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

本研究选取山东省潍坊市某奶牛场对隐性乳房炎最常见的病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌进行分离鉴定和数据统计，三种病原菌在该场的检出率分别为27.88%、11.54%和7.69%，在随后对其他七个奶牛场的部分乳样的细菌分离结果中证明，该三种病原菌在潍坊地区奶牛隐性乳房炎乳汁中广泛存在。

隐性乳房炎 病原菌 分离鉴定

极大多数乳房炎是由病原菌感染引起。从乳房中分离到130种引起乳房炎的病原微生物，其中包括细菌、真菌、病毒、支原体等。各种病原微生物的感染，因地区以及管理状况的不同而异。临床上主要以病原细菌感染为主。其中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌为奶牛隐性乳房炎牛乳中分离的最主要的细菌。

金黄色葡萄球菌是隐性乳房炎最主要的病原，而且还可以引起临床型、脓毒性乳房炎，已成为某些牛场或牛群中的主要问题。刘文进等通过对新疆北疆地区泌乳奶牛随机抽样调查表明，葡萄球菌的检出率为90%以上，其中，金色葡萄球菌占70%~80%。金葡菌存在于感染乳房内，同时可以寄生于乳头皮肤、乳头口、扁桃体、阴道和全身皮肤上等，但乳头皮肤上最多，特别在乳头发生创伤时最易生长繁殖。此菌主要来自感染部位的分泌物经挤奶工的手、机器挤奶杯或如同抹布等，通过乳头口感染于乳腺内。

无乳链球菌为链球菌中危害最大、最常见、具有高度传染性的一种病原菌，是感染乳区经乳汁大量排出的细菌。该链球菌主要在挤奶时通过乳头口传给非感染乳区乳腺内，若不采取有效措施，无乳链球菌可在牛群中迅速扩散蔓延。被无乳链球菌感染的乳区体细胞数很高，有时奶超过100万个/ml。奶中的细菌含量往往也很高。为防治无乳链球菌，在挤奶时应注意卫生，特别要强调在挤奶后用消毒剂药浴乳头，可明显抑制该病菌的传播。

大肠杆菌类细菌为环境性菌，与奶牛乳房炎最密切的有大肠杆菌、克雷伯氏菌，此菌存在与粪便、污水、被污染的垫料中，在奶牛环境中普遍存在。

奶牛隐性乳房炎最可靠的诊断方法是对某头奶牛的牛奶做细菌分离培养以便鉴定细菌种类，并确定选用最适合的抗菌素治疗。本研究选取山东潍坊某奶牛场隐性乳房炎阳性的83头奶牛作为研究对象，对乳样中的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌三种主要病原菌进行分离和鉴定，并对三种病原菌在该地区隐性乳房炎的存在情况进行存在性调查。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验奶牛 某奶牛场LMT检测阳性奶牛83头，其它各场随机选取非临床型乳房炎泌乳牛奶牛各10头。

1.1.2 各种培养基 （1）分离用培养基。肉汤：含10%血清，用于增菌培养和鉴定细菌的辅助培养基。鲜血琼脂平板和斜面：含3%羊鲜血，用于营养需求比较高的细菌的分离培养、链球菌的溶血现象观察和CAMP试验，以及菌种的保存。改良爱德华琼脂平板：含醋酸铊和结晶紫，用于链球菌的选择培养和鉴别。却甫曼琼脂平板：含7.5%NaCl，用于葡萄球菌的选择培养和鉴别。麦康凯琼脂平板：用于肠道杆菌的选择培养和鉴别。（2）鉴别用生化反应培养基。糖发酵管、0.1%马栗苷、1%马尿酸钠、0.1%美蓝脱脂奶、6.5%NaCl、pH9.6肉汤、40%牛胆汁琼脂、半固体甘露醇、石蕊牛奶、O/F(氧化/发酵)琼脂、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂斜面、尿素琼脂斜面、三糖铁琼脂斜面、半固体琼脂、明胶、兔血浆等。（3）LMT诊断液。购自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 乳样采集 挤奶前用40℃左右0.02%~0.03%高锰酸钾温水溶液消毒手指，毛巾消毒后拧干备用。用消毒湿毛巾擦拭乳头和乳房。按摩乳房，将挤出的头2~3把奶弃掉。LMT检测。然后70%酒精棉球消毒乳头和采样人员的手指，无菌操作采集经LMT检测阳性乳区乳样5~10ml，注入灭菌试管中，标明牛号、乳区、日期等，送4℃冰箱保存，并尽快做细菌分离。

1.2.2 常见病原菌分离 分别将乳样接种到：改良爱德华琼脂平板、却甫曼琼脂平板、麦康凯琼脂平板、营养肉汤等培养基，将接种好的培养基置于37℃恒温箱中培养18~24h，观察细菌生长情况。并根据细菌分离情况对常见病原菌进行鉴定。（1）金黄色葡萄球菌的分离鉴定。在却甫曼琼脂平板上直径约1.5~2mm、呈金黄色的菌落，怀疑为金黄色葡萄球菌，挑取单个菌落接种鲜血琼脂平板，经37℃培养18~24h后，挑取鲜血琼脂平板上形成β-溶血的菌落进行涂片和革兰氏染色，油镜检查。如菌落不均一，或者镜检细菌菌体形态特征不均一，说明细菌不纯粹，挑取单一菌落进行纯化，并用同法进行染色镜检，直到得到细菌的纯培养。然后进行如下生化试验：有氧甘露醇发酵试验、无氧甘露醇发酵试验、兔血浆凝固酶试验、O/F、过氧化氢酶试验等，以鉴定其致病性。记录金黄色葡萄球菌的阳性检出率。（2）无乳链球菌的分离鉴定。在改良爱德华琼脂平板上直径约1~ 1.5mm、呈浅紫色、褐色或黑色的单个菌落，怀疑为链球菌，接种于鲜血琼脂平板上，倒置于37℃恒温箱中培养18~24h，观察菌落溶血情况，并挑取上述各种菌落进行涂片和革兰氏染色镜检，如菌落特征和菌体特征均一则进行生化鉴定，否则连续平板分离，直到获得细菌的纯培养物。用获得的链球菌纯培养物进行下列试验：链球菌的CAMP试验、马栗苷发酵试验等，以鉴定链球菌的群。记录无乳链球菌的阳性检出率。（3）大肠杆菌的分离鉴定。在麦康凯琼脂平板上直径约2~3mm、呈粉红色不透明的菌落怀疑为大肠杆菌，挑取单个菌落接种于营养琼脂平板，倒置于37℃恒温箱中培养18~24h，观察菌落特征，并进行涂片和革兰氏染色，如菌落特征和菌体形态染色特征均匀一致，则进行生化鉴定，否则，连续平板分区划线培养和形态染色鉴定，直到获得细菌的纯培养物，并进行下列生化试验：葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验、麦芽糖发酵试验、甘露醇发酵试验、硫化氢试验、尿素酶试验、靛基质试验、甲基红试验、V-P试验、枸橼酸盐利用试验、明胶液化试验等，根据生化试验结果做出鉴定。记录大肠杆菌的阳性检出率。

表1 金黄色葡萄球菌主要生化试验特性

表2 无乳链球菌的主要生化特性

表3 大肠杆菌的主要生化特性

1.2.3 七个奶牛场的细菌分离鉴定 用相同的试验方法对其他七个奶牛场中LMT检测阳性的乳区各采集乳样10份进行三种病原菌的分离和鉴定，记录各病原菌的阳性检出数。

2 试验结果

2.1 细菌分离鉴定结果

经LMT检测，检出阳性牛83头，阳性乳区141个。经细菌分离实验，共有91份乳样检出细菌104株。乳样细菌检出率64.54%。经细菌生化实验鉴定金黄色葡萄球菌29株、无乳链球菌12株、大肠杆菌8株，检出率(分离鉴定株数/细菌分离总株数)分别为27.88%、11.51%和7.69%，三种病原菌的检出率为47.08%。

表4 某奶牛场金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的检出率

2.2 七个奶牛场的细菌分离鉴定结果

金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌在其他七个奶牛场的检出数见表5。

表5 七个奶牛场三种病原菌检出份数

3 讨论

通过对山东潍坊某奶牛场的三种主要病原菌的分离和鉴定，结果表明，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌在该场患隐性乳房炎的奶牛中普遍存在，且检出率均较高，是引起该场隐性乳房炎的主要病原菌。通过对潍坊地区其他七个奶牛场随机采集的各10份乳样进行的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的检测，结果表明，三种主要病原菌在潍坊地区奶牛场隐性乳房炎乳样中广泛存在。

大量文献表明，引起奶牛隐性乳房炎的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌。有关山东省的研究资料证实了这一点。马保臣等对山东济南某规模化奶牛场隐性乳房炎乳样病原菌检查结果为细菌检出率73.24%，葡萄球菌检出率17.61%，链球菌检出率11.97%，肠杆菌检出率18.31%。郭龙宗等对烟台地区某奶牛场细菌分离结果表明，头细菌检出率75%，乳区细菌检出率69%，证实链球菌和葡萄球菌是引起该场隐性乳房炎的主要病原菌。贾玉萍等2004年对济南5个奶牛场的147份隐性乳房炎乳样进行了细菌分离鉴定，细菌检出率68.03%，鉴定的细菌主要有葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等。陈德等对青岛某奶牛场隐性乳房炎乳样分离鉴定出83株细菌，其中金黄色葡萄球菌13株，无乳链球菌11株，大肠杆菌6株，占细菌分离数的36%。王志远等在青岛某奶牛场的隐性乳房炎乳样中分离出65株细菌，其中金黄色葡萄球菌21株(占32.31%)，无乳链球菌23株(占35.38%)，大肠杆菌7株(占10.77%)。

引起奶牛乳房炎的病原菌有多种，常见的也有20多种。各种病原微生物的感染，因地区以及管理状况的不同而异。文献对奶牛隐性乳房炎的细菌分离鉴定结果并不统一，有的相差较大。张晓菊等对金华市某奶牛场主要细菌的分离鉴定结果表明，该场奶牛隐性乳房炎的主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌，占51%；大肠杆菌未检出，据分析与该场饲养管理水平较高、综合防治措施实施较好有关。

本试验只对引起潍坊地区隐性乳房炎的三种主要病原菌进行了分离鉴定，三种病原菌的检出率只有47.08%，各奶牛场的主要致病菌是否一致，本地区是否存在其他主要病原菌有待进一步研究。

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（2012–04–17）

S823.9+1

A

1007-1733(2012)09-0001-03