杨田田,傅仲鹰,王 苹,杨立新

(吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林 长春130021)

热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是细胞受应激原刺激后诱导所产生的一种最为常见的应激蛋白，被认为是保护真核细胞免受损害的最重要的蛋白。近来研究发现:HSP70高表达与肿瘤密切相关，在正常组织中多不表达，但在多种肿瘤中有不同程度的表达,如乳腺癌中有高表达[1],其高表达可能与肿瘤的发生、发展和预后有关。目前研究表明：HSP70在包括头颈部鳞状细胞癌在内的多种肿瘤组织都有异常表达,如在喉癌中表达[2]已有报道，但大多数报道与肿瘤的治疗、预后有关，而针对HSP70在喉乳头状瘤和声带白斑组织中的表达对喉癌的早期防治方面的相关报道较少。本文作者拟通过检测HSP70及其上游调控因子HSF1在喉乳头状瘤和声带白斑中的表达,探讨HSP70与喉癌发生的关系，进一步揭示HSP70在喉癌发生、发展中的作用，为喉癌的早期诊断和防治提供一种新的途径。

1 资料与方法

1.1 主要试剂兔抗HSP70抗体和HSF1抗体购于北京博奥森公司，SP试剂盒购于福建迈新公司，其他化学试剂购于北京化工厂。

1.2 标本来源和临床资料标本来源于2008年1月—2011年6月在吉林大学第一医院接受手术的7例声带息肉、6例喉乳头状瘤和6例声带白斑,所有病例临床资料完整，年龄29～59岁，平均35.1岁。以声带息肉为对照组。

1.3 免疫组织化学染色将取下的新鲜组织块迅速置入10%中性甲醛中固定24 h，PBS洗涤3次，常规脱水透明，石蜡包埋，制成厚度为3 μm的切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水化。采用SP染色方法，具体如下：切片加入3%过氧化氢，室温孵育10 min，PBS洗涤5 min，去除内源性过氧化物酶的活性。然后将切片置于96℃、 0.01 mol·L-1枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，孵育10 min进行抗原修复。PBS洗涤，滴加正常山羊血清室温孵育10 min，然后滴加浓度为1∶100兔抗人HSP70或HSF1多克隆抗体，4℃过夜。PBS缓冲液洗5 min×3，滴加生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育15 min。PBS缓冲液洗，滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，室温孵育15 min。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。用PBS缓冲液代替一抗作为标本染色的阴性对照。

1.4 蛋白表达半定量分析切片于低倍镜和高倍镜下观察，每张免疫组织化学染色切片随机选取5个高倍视野，Leica显微镜拍照，免疫组织化学半定量分析综合评分采用H-score法[3]。①根据染色强度进行评分：淡棕黄色为1分，深棕黄色为3分，介于两者之间为2分。②根据阳性细胞百分数进行评分：10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色检测HSP70在喉组织中的表达HSP70阳性表达为棕黄色颗粒，定位于细胞浆和细胞核。在声带息肉中低水平表达，HSP70表达主要定位于细胞核。在喉乳头状瘤、声带白斑表达较强，见图1(封三)。H-score法半定量结果表明：喉乳头状瘤组HSP70表达(4.25±0.53)与声带息肉组(3.63±0.58)比较明显增高(P<0.05)，声带白斑组HSP70表达最强(5.43±0.40)，与声带息肉组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 免疫组织化学染色检测HSF1在喉组织中的表达HSF1阳性表达为棕黄色颗粒，大部分定位于细胞浆，少量细胞核。其表达趋势与HSP70表达趋势相似，见图2(封三)。H-score法半定量结果显示：乳头状瘤组HSF1表达(3.80±0.42)与声带息肉组(3.17±0.47)比较明显增高(P<0.05)，声带白斑中HSF1表达最强(4.52±0.48)，与声带息肉组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 HSP70和HSF1在喉组织中表达的相关性对声带息肉、喉乳头状瘤和声带白斑组织中HSP70蛋白表达量与HSF1表达的关系进行直线回归分析，结果显示：HSP70蛋白表达量与HSF1的变化呈现正的直线相关(r=0.867，P<0.01)，即随着HSP70蛋白表达量的增加，HSF1表达亦增加，二者正相关。见图3。

3 讨 论

HSP70是所有原核和真核细胞在高温或应激情况下产生的一组非常保守的蛋白质分子,作为分子伴侣可以控制蛋白质的质量或与许多重要的调节因子相互作用调节细胞的增殖、生存和死亡[4]。研究表明：肿瘤形成期间有大量的HSP70表达，高表达的HSP70可调节肿瘤的增殖。李全香等[5]研究发现：HSP70在正常宫颈上皮、CIN及宫颈癌组织中的表达逐渐增高。Kaur等[6]比较正常口腔上皮细胞、异型性细胞及鳞癌细胞,观察到三者的HSP70表达顺次明显增强,说明癌变后细胞内HSP70的合成增加。其机制可能为HSP70是正常细胞周期中CDC2-CyclinB复合体和CDC2激酶活性所必需的蛋白，高表达的HSP70促进肿瘤细胞的有丝分裂。有学者[7]用HSP70反义核酸转染胃癌细胞系SCG-7901后可以观察到，细胞在G1期和S期数量减少，提示下调HSP70表达能够抑制细胞的生长。本实验结果表明：喉乳头状瘤和声带白斑黏膜组织中HSP70的表达明显高于声带息肉，声带白斑中的表达最高。因此推测声带白斑的发生可能与其高表达的HSP70有关，HSP70可能通过影响细胞周期，导致肿瘤细胞异常增殖，促进喉癌前病变细胞的恶性转化。

图3 喉组织中HSP70与HSF1表达的直线回归分析图

HSF1是肿瘤发生的一个有力的调节因子，促进肿瘤细胞的恶性转化。研究[8-9]表明：散发性消化道癌，如胃肠癌及乳腺癌等肿瘤中均发现HSF1的高表达。Hoang等[10]报道：人前列腺癌的发生与HSF1相关，HSF1在转移型前列腺癌细胞系中呈过表达，且其表达水平与前列腺癌的恶性程度呈正相关，恶性程度越高,HSF1和HSP表达水平越高。HSF1作为调控真核生物热休克反应的转录细胞因子，主要通过诱导HSPs的表达，参与细胞的增殖和生长。Meng等[11]采用RNAi技术沉默HSF1基因，发现下调的HSF1能够抑制乳腺癌细胞系MCF-10A在裸鼠体内移植瘤的形成和生长，认为HSF1通过HSPs调控肿瘤生成。HSF1基因敲除后，HSP72和HSP27表达下降，p21基因表达增加，同时下调与细胞增殖关系密切的survivin基因，导致肿瘤细胞生长阻滞和细胞老化。Rossi 等[12]在宫颈癌的研究中发现：HSF1基因沉默，直接抑制HSP70 等热激蛋白的表达，导致大量的肿瘤细胞凋亡，从而使宫颈癌得到控制。Wang等[8]发现：HSF1通过抑制XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)基因表达参与胃癌的发生和发展。HSF1 还在p53 的核转运过程中有重要作用，因此HSF1也可能通过调节p53活性影响肿瘤的发生[13]。

本实验结果显示：HSF1蛋白在声带息肉、喉乳头状瘤和声带白斑中的表达与HSP70趋势基本相似，同样在声带白斑中高表达；半定量结果显示：HSP70和HSF1表达强弱程度呈现一致性；相关性分析发现:HSP70蛋白表达与HSF1的变化呈现正的直线相关。提示在喉组织中HSF1主要通过诱导HSP70过表达参与喉癌的发生。本文作者推测高表达的HSF1激活HSP70参与喉癌早期的形成，HSF1和HSP70有望成为判断喉癌发生的指标。

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