梁 冰，刘晓冬，徐慧英，信 瑞，孔德娟，贺梦子，贾立立，徐 波，马淑梅

(吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021)

子宫颈癌是仅次于乳腺癌的全球第二种最常见的妇科恶性肿瘤，而且发展中国家所占发病比例极高(> 80%)[1]，严重危害妇女的健康与生命。目前，放疗作为宫颈癌治疗的常规手段，广泛地应用于临床，而化疗因其作用效果存在争议，应用范围较小。据统计约有80%的宫颈癌患者需要以放射治疗作为单独治疗或综合治疗，虽然早期患者放射治疗效果较好，但是中、晚期患者的治疗效果仍较差，主要原因是辐射敏感性不理想等问题。因此，如何提高肿瘤的放射敏感性，成为当前宫颈癌治疗的关键问题之一。近年来，随着分子生物学的发展，发现某些基因的表达在分子水平上影响着肿瘤细胞的放射敏感性。脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,DCK)是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶，在维持正常的脱氧核苷库方面起着重要的生理学作用。大量研究[2-3]发现：电离辐射和其他基因毒性因子刺激可引起细胞DCK激酶活性增高而促进DNA损伤的修复。目前，有关RNA干扰技术沉默HeLa细胞DCK基因改变其放化疗敏感性的研究尚未见报道。本研究利用干扰技术特异性地阻断DCK 基因在宫颈癌细胞中的表达，观察其对人宫颈癌细胞药物敏感性及辐射敏感性的影响，为宫颈癌的基因治疗提供新的靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器实时定量PCR所需引物及RNAiso plus、SYBR Premix Ex Taq试剂盒(荧光为SYBR Green Ⅰ)等均购自大连宝生物公司。DCK一抗为英国Abcam公司产品；GAPDH一抗、增强化学发光法(ECL)发光试剂盒等为Santa Cruz 公司产品；羊抗兔及兔抗鼠二抗购自北京中山金桥公司。

1.2 细胞培养与照射人宫颈癌细胞HeLa由本实验室保存，用DMEM培养基(含10%FBS及青霉素与链霉素各100 U·mL-1)，37℃、5%CO2培养箱中培养。照射采用国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机，滤板0.5 mm Cu+1.0 mm Al。照射条件为靶皮距600 mm，吸收剂量率0.41 Gy·min-1。

1.3 细胞转染细胞计数并在含血清、但不含抗生素的正常培养基中铺板，转染当天细胞密度达到50%～80%。取FuGENE 6 30 μL，用无血清培养基稀释到100 μL，混匀孵育5 min，10 μg DCK siRNA质粒(由美国Methodis Hospital Research Institute，徐教授惠赠)用无血清培养基稀释至100 μL，二者混匀并孵育30 min，逐滴加入HeLa细胞中，转染48 h后用浓度为1 mg·L-1嘌呤霉素筛选至阳性克隆出现。

1.4 实时定量PCR检测DCK基因表达根据GenBank中序列设计引物，目的基因引物序列：DCK，5′-TGCAGGGAAGTCAACATT-3′和5′- TCCCACCATTTTTCTGAG-3′；内参GAPDH引物序列，5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和5′-CATTCCATTCCACGGGAACAC-3′。PCR扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性20 s，60℃退火延伸20 s；循环45次。以假照组为校正样本，按照ΔΔCt解析法来进行目的基因与管家基因的相对定量。

1.5 Western blotting检测DCK蛋白的表达收集细胞，加入适量含有PMSF单去污裂解液，冰浴30 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清移入新Ep管中。蛋白煮沸5 min进行变性，用10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转移至硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗于 4°C摇床过夜，二抗反应90 min，ECL化学发光法显色，X光胶片显影。

1.6 细胞增殖情况测定取指数生长期的3组细胞，计数后按1×104接种于12孔板内，分别于24、48、72、96、120、144、168、192 h计数孔内细胞总数，每个时间点设3个复孔。

1.7 MTT检测细胞药物敏感性将空白对照组、阴性对照组及DCK siRNA组的HeLa细胞以4 000个/孔数量接种于96孔板。AraC药物组：浓度分别为0、0.05和0.1 μmol·L-1；每个浓度设3个复孔，药物作用48 h后检测细胞存活率。选择490 nm波长，酶标仪测定各孔吸光度(A)值，细胞存活率(%)=实验组A值 /对照组A值×100%，设对照组细胞存活率为1。

1.8 克隆形成实验检测细胞辐射敏感性将750、2 000、4 000、6 000、8 000个/皿细胞分别接种于6孔板中，每组均设3复孔，分别照射0、2、4、6、8 Gy，37℃、5%CO2培养箱中培养10 d，弃掉培养基，PBS小心清洗，甲醇固定30 min，GIEMSA染色10 min，自然晾干后计数≥50个细胞的单克隆数，计算克隆形成率及存活分数。克隆形成率(%)=(克隆细胞数/接种细胞数)×100%，存活分数=照射后细胞的克隆形成率/未受照射细胞的克隆形成率。

2 结 果

2.1 转染前后细胞中DCK mRNA的表达实时定量PCR结果显示：转染HeLa后，siRNA组DCK mRNA表达水平(0.38±0.08)与空白对照组及阴性对照组(1.00±0.12和0.89±0.15)比较均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；2个对照组间DCK mRNA表达水平接近，差异无统计学意义(P>0.05)，表明DCK siRNA对DCK基因的干扰沉默作用具有特异性。

2.2 转染前后细胞中DCK蛋白的表达Western blotting结果显示：转染后siRNA组DCK蛋白表达水平(0.22±0.05)与空白对照组及阴性对照组(1.00±0.07和0.96±0.12)比较均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；2个对照组间DCK蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与DCK mRNA的表达结果一致。见图1。

图1 DCK蛋白表达结果

2.3 细胞增殖情况测定结果为了比较空白对照组、阴性对照组及DCKsiRNA组的HeLa细胞生长速度是否存在差异，采用细胞计数的方法对不同时间的3组细胞的增殖进行监测，结果显示:3组细胞的增殖速度接近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同时间各组HeLa细胞的增殖情况

2.4 沉默DCK后Hela细胞药物敏感性的变化MTT结果显示： AraC药物作用后48 h，siRNA组细胞存活分数明显高于阴性对照组及空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而2个对照组HeLa细胞的细胞存活分数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同剂量AraC作用下HeLa细胞的存活分数

2.5 沉默DCK后宫颈癌细胞辐射敏感性的变化克隆形成结果显示：siRNA组细胞存活分数明显少于阴性对照组及空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而2个对照组HeLa细胞的细胞存活分数无明显差异(P>0.05)。见表3。

表3 不同剂量电离辐射作用下HeLa细胞的存活分数

3 讨 论

DCK基因位于染色体的 4q13.3-q21.1,约含有2 618 bp,是一种相对分子量为61 000的磷酸激酶，包括2个30 500的相同亚基。DCK表达水平具有组织特异性，胸腺和白血病的T淋巴细胞中的DCK活性要比其他类型细胞中同一种酶的活性高。其主要存在于细胞质内，集中在细胞核周围和细胞膜区域，如果DCK过量表达，则主要集中在细胞核内。DCK作为磷酸激酶，显示出广泛的底物特异性，除了自然产生的dAdo、dGuo及dCyd外，DCK还是AraC、CNDAC等核苷类化疗药物活化的限速酶和关键酶。DCK 活性降低或丧失,可导致细胞对一系列化疗药物产生耐药。研究[4-6]表明：肿瘤耐药细胞中存在一个或多个DCK基因结构的突变，或者基因的高度甲基化，导致DCK表达降低或不表达，从而使AraC和CNDAC等药物活化受抑制，导致肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低。有学者用逆转录病毒或腺病毒将DCK基因导入细胞增加DCK的活性,可以提高细胞对药物的敏感性。动物实验[7]也显示：通过基因转染方式增加DCK活性，动物在给予抗癌药吉西他滨后，肿瘤体积缩小。本实验结果显示：DCK siRNA组细胞中DCK mRNA及蛋白的表达水平与空白对照组及阴性对照组比较明显降低；细胞计数法检测结果提示，沉默DCK基因对细胞生长无明显影响；AraC作用48 h后siRNA组中细胞存活分数明显高于阴性对照组及空白对照组，由于DCK被沉默后降低AraC药物磷酸化，抑制其活化，进而减弱细胞毒性作用[8-9]。提示沉默DCK的HeLa细胞对AraC的药物敏感性降低。

放射治疗是恶性肿瘤治疗的主要手段，单纯放射治疗常导致治疗失败，加大放疗剂量则导致正常组织的放射性损伤，研究[10]表明：肿瘤细胞对放疗的敏感性可能是决定放射治疗疗效的关键因素。影响肿瘤放射敏感性的因素有很多，包括DNA双链断裂修复效率、细胞周期阻滞和细胞凋亡等，由于电离辐射对DNA的主要损伤形式是DNA双链断裂，所以DNA 双链断裂修复效率被认为是影响放疗敏感性的首要决定因素[11]。研究显示：DCK与肿瘤细胞放射敏感性密切相关；van Den Neste等[12]发现：用B-CLL细胞经30 J·m-2UV-C照射30 min后，DCK活性增高3倍，细胞进行积极的DNA损伤修复，证明DCK活性上调有助于细胞对UV引起的DNA损伤修复，因此,DCK可能是肿瘤细胞放射增敏的理想靶点。本实验结果显示：不同剂量电离辐射照射后DCK siRNA组细胞存活分数与对照组比较显著降低，可能是DCK基因的沉默降低了天然脱氧核苷酸底物磷酸化程度，减少了DNA合成补救途径所需的dNTPs底物[13]，DNA损伤修复无法完成，使辐射敏感性增加。

本实验结果表明：siRNA阻断DCK mRNA及蛋白的表达，可以降低宫颈癌细胞对药物的敏感性及提高对辐射的敏感性，DCK可以作为对宫颈癌治疗的一个潜在靶点。

[参考文献]

[1]Costa LS,Telles CB,Oliveira RM,et al.Heterofucan from Sargassum filipendula induces apoptosis in HeLa cells [J].Mar Drugs,2011,9(4): 603-614.

[2]Sigmond J,Haveman J,Kreder NC,et al.Enhanced activity of deoxycytidine kinase after pulsed low dose rate and single dose gamma irradiation [J].Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,2006,25(9-11):1177-1180.

[3]Haveman J,Sigmond J,van Bree C,et al.Time course of enhanced activity of deoxycytidine kinase and thymidine kinase 1 and 2 in cultured human squamous lung carcinoma cells,SW-1573,induced by gamma-irradiation [J].Oncol Rep,2006,16(4):901-905.

[4]van Bree C,Castro-Kreder N,Loves WJ,et al.Sensitivity to ionizing radiation and chemotherapeutic agents in gemcitabine-resistant human tumor cell lines[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2002,54(1):237-244.

[5]Song JH,Kim SH,Kweon SH,et al.Defective expression of deoxycytidine kinase in cytarabine-resistant acute myeloid leukemia cells[J].Int J Oncol,2009,34(4):1165-1171.

[6]Qin T,Jelinek J,Si J,et al.Mechanisms of resistance to 5-aza-2′-deoxycytidine in human cancer cell lines[J].Blood,2009,113(3):659-667.

[7]Braess J,Voss S,Jahns-Streubel G,et al.The pharmacodynamic basis for the increased antileukaemic efficacy of cytosine arabinoside-based treatment regimens in acute myeloid leukaemia with a high proliferative activity[J].Br J Haematol,2000,110(1):170-179.

[8]Réjiba S,Bigand C,Parmentier C,et al.Gemcitabine-based chemogene therapy for pancreatic cancer using Ad-dCK:UMK GDEPT and TS/RRsiRNA strategies [J].Neoplasia,2009,11(7):637-650.

[9]Sigmond J,Bergman AM,Leon LG,et al.Staurosporine increases toxicity of gemcitabine in non-small cell lung cancer cells: role of protein kinase C,deoxycytidine kinase and ribonucleotide reductase[J].Anticancer Drugs,2010,21(6):591-599.

[10]吴晓芬,洪承皎,郭文秀,等.槲皮素对HeLa细胞辐射敏感性影响及其机理[J].辐射研究与辐射工艺学报,2011,29(2):104-108.

[11]Mondello C,Smirnova A,Giulotto E.Gene amplification,radiation sensitivity and DNA double-strand breaks[J].Mutat Res,2010,704(1-3):29-37.

[12]van Den Neste E,Smal C,Cardoen S,et al.Activation of deoxycytidine kinase by UV-C-irradiation in chronic lymphocytic leukemia B-lymphocytes[J].Biochem Pharmacol,2003,65(4):573-580.

[13]Keszler G,Szikla K,Kazimierczuk Z,et al.Selective activation of deoxycytidine kinase by thymidine-5′-thiosulphate and release by deoxycytidine in human lymphocytes[J].Biochem Pharmacol,2003,65(4):563-571.