崔殿龙，解百宜，胡 蒙，向 欣，包传恩，陈玉强

(1.厦门大学附属成功医院 解放军第一七四医院肿瘤外科，福建 厦门 361003；

2.厦门大学附属成功医院 解放军第一七四医院肿瘤内科，福建 厦门 361003)

目前已经证实甲状腺激素(T3及T4)对乳腺、神经胶质以及甲状腺肿瘤细胞增殖可发挥促进作用。另外，通过对一种突变型甲状腺激素核受体的转基因鼠研究发现，甲状腺激素核受体能加速浸润性甲状腺癌的发生，与肿瘤细胞生长相关[1]。近期临床证据表明：甲状腺功能减退可以影响多形性成胶质细胞瘤和乳腺癌的生长[2]。有研究[3-4]证实: 一种脱氨基形式的甲状腺激素—四碘甲腺乙酸(tetraiodothyroacetic acid，Tetrac)可拮抗多种激素的促增殖效应，并通过抑制细胞增殖和血管形成发挥抗肿瘤功能。目前已发现肿瘤的多种药物抵抗机制，包括表达药物抵抗泵基因[5]，其产物能插入细胞膜，将化疗药物运出到细胞外基质，而甲状腺激素可以作用于Na+/H+逆向转运[6]等质膜运输系统。本文作者研究使用Tetrac抑制阿霉素(doxorubicin,Dox)抵抗性人胃癌细胞系SGC-7901/R体内外增殖的可能性及可能机制，旨在为耐药性胃癌治疗提供实验依据。目前国内外尚无相关文献报道。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂人胃癌细胞系SGC-7901为本实验室保存。DMEM和胎牛血清购自美国Invitrogen公司。Dox和Tetrac购自美国Sigma公司，14C标记的Dox和增强化学发光试剂(ECL)购自美国Amersham公司，药物转运子P糖蛋白(drug transporter P-glycoprotein，P-gp)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase，GST)抗体以及β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国BioRad公司。通过肿瘤细胞与Dox孵育，逐渐增加药物浓度(从10-9mol·L-1到10-5mol·L-1)，培养6个月以上即构建成功药物抵抗细胞系(SGC-7901/R)。

1.2 体外实验体外实验分为SGC-7901与SGC-7901/R 2组，分别与不同浓度Tetrac(25～125 mg·L-1)以及经典抗肿瘤药物依托泊苷(Etop，10-4mol·L-1)、Dox(10-7mol·L-1)、顺铂(Cisp，10-6mol·L-1)共同培养4 d，或首先使用Tetrac(30 mg·L-1)预处理，然后分别用上述经典抗肿瘤药物孵育4 d。MTT法检测其细胞活性，最终结果以不同药物浓度下的肿瘤细胞存活率来表示。

1.3 Western blotting检测培养单层细胞至90%融合，用PBS冲洗后，使用50 mmol·L-1HEPES(pH 7.4)、150 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1NaF、1 mmol·L-1MgCl2、1.5 mmol·L-1EGTA、10%甘油、1%TritonX-100、1 mg·L-1亮抑酶肽和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟裂解细胞。通过12% SDS-PAGE电泳分离等量蛋白，并将其转移至醋酸纤维素膜上。使用特异性一抗和二抗标记特异性蛋白并通过辣根过氧化物酶及ECL感光胶片显色。分析Tetrac、Dox单独或联合应用对SGC-7901/R中相关耐药基因P-gp、SOD和GST表达的影响。

1.4 Dox聚集度检测Dox抵抗细胞接种在12孔板中，孵育24 h后加入14C标记的Dox(185 Bq)，加或不加入Tetrac(30 mg·L-1)继续孵育24 h。用冰冷PBS清洗细胞3次并裂解。用液闪仪检测裂解产物中Dox聚集度。细胞比例高。

1.5 衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-b-Gal)染色细胞种植在24孔板中，用DMEM培养24 h，Dox、Tetrac单独或联合加入并培养5 d。常规β-半乳糖苷酶染色[5]。主要步骤包括：①用3%甲醛孵育5 min 固定细胞；②冲洗后在37°C与X-gal(1 g·L-1)孵育，使用含40 mmol·L-1柠檬酸(pH 6.5)、5 mmol·L-1氰亚铁酸钾、5 mmol·L-1铁氰化钾、150 mmol·L-1NaCl和2 mmol·L-1MgCl2的溶液溶解；③24 h后在相差显微镜下照相。最终结果以染色阳性细胞百分比来表示，阳性细胞比例高说明衰老细胞比例高。

1.6 凋亡相关的烟酸已可碱(Hoechst)染色细胞接种在100 mm培养皿中，Dox、Tetrac单独或联合加入并培养24 h。使用胰酶在37°C消化3 min。离心获得细胞后用4%甲醛固定。PBS冲洗后用0.1 mg·L-1Hoechst 33248孵育，在玻片上显色并用显微镜观察，计数阳性细胞。阳性细胞比例高说明凋亡细胞比例高。

1.7 实验动物Balb/c系裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司(5～6周龄，体质量30 g左右)。腋部皮下注射SGC-7901/R细胞(106·100 μL-1)，肿瘤生长至50 mm3左右时动物被分成4组(n=7)：①生理盐水对照组；②Tetrac治疗组(30 mg·kg-1)；③Dox治疗组(2 mg·kg-1)；④Tetrac(30 mg·kg-1)+Dox(2 mg·kg-1)联合药物治疗组。每组小鼠均在第10、13及16天连续3 d每日1次、共进行3次腹腔注射。观测小鼠体质量,检测药物毒性和致死剂量。每周使用游标卡尺测量肿瘤直径3次，连续测量3周以上。使用公式V=宽度×长度2/2计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。

2 结 果

2.1 Tetrac对SGC-7901和SGC-7901/R细胞系增殖的抑制作用Dox组SGC-7901细胞活性随Dox浓度逐渐增大而明显减弱，SGC-7901/R细胞只在极高浓度情况下(>10-6mol·L-1)才开始发生坏死(图1A)。在Tetrac干预组，无论是Dox敏感还是抵抗细胞系均随Tetrac浓度升高而坏死明显加快，在100 mg·L-1时细胞全部死亡(图1B)。

2.2 Tetrac对经典抗肿瘤药物的增强作用Dox、Etop及Cisp 3种药物分别联合Tetrac作用于SGC-7901/R细胞系，其抑制作用比单独应用时明显增强(P<0.001)。见表1。

图1 Tetrac对Dox敏感性和抵抗性肿瘤细胞增殖的作用

表1 Tetrac对药物抵抗的逆转作用

2.3 Tetrac作用下肿瘤细胞对药物的敏感性与SGC-7901细胞比较，P-gp转运子在Dox抵抗的SGC-7901/R细胞中过表达，而其他药物抵抗分子(如SOD和GST)的表达在2个细胞系间并无明显差别(图2A);Western blotting结果表明：Tetrac和Dox单独或联用均未影响SGC-7901/R中多种药物抵抗基因P-gp、SOD和GST的表达(图2B)。放射性标记的Dox检测结果显示：与单独应用Dox组 [(623.70±116.45)DPM/106细胞]比较，Tetrac处理后细胞内Dox的浓度[(1 486.50±39.33)DPM/106细胞]明显增高(P<0.001)，表明P-gp的功能可被Tetrac所抑制。

2.4 Tetrac对药物抵抗细胞发生衰老和凋亡的促进作用2个单独用药组衰老细胞均很少，而联合用药组处于衰老状态的细胞百分比明显升高(P<0.001)，表明联合用药组的大部分细胞处于凋亡状态。见表2。

2.5 Tetrac对药物抵抗性肿瘤体内增殖能力抑制作用Dox的最大耐受剂量是2.5 mg·kg-1，而Tetrac即使应用超过60 mg·kg-1也未产生毒副作用。Dox组肿瘤生长无改变，而Tetrac组肿瘤体积减少70%。联合用药效果并未进一步增加，说明在使用浓度上二者不具备明显的协同作用。见图3。

图2 Tetrac对经典药物抵抗基因和药物转运子表达的影响

表2 Tetrac对药物抵抗细胞发生衰老和凋亡的促进作用

图3 Tetrac对裸鼠中Dox抵抗性肿瘤增殖的影响

3 讨 论

肿瘤细胞的明显特点是有一定适应能力，能对任何类型的压力产生抗性。从临床观点来看，这可能是治疗失败或肿瘤再发的重要原因。因此，研发预防肿瘤产生耐药性的方法具有很重要的临床意义。近年来，抗肿瘤药的品种增加很快，主要集中在抑制多种离子通道方面。这些药物在体外多有逆转肿瘤药物抵抗的作用，但在体内却经常失去作用，有的还具有高毒性。在研究新型、低毒的药物抵抗调节剂时，人们发现了甲状腺激素拮抗剂Tetrac[7]。与其他物抵抗逆转性药物不同，Tetrac无明显毒副作用，可同时作用于药物转运子和控制药物敏感性的信号途径，导致细胞衰老甚至凋亡;这些特点使Tetrac成为一种新型的抗肿瘤药物[8-10]。

本文作者最初发现:Tetrac在体外抑制药物敏感性和抵抗性细胞的效果相当，表明这种拮抗剂具有克服药物抵抗的作用。SGC-7901/R细胞对于Dox、Etop和Cisp的敏感性在加入Tetrac后明显增强。由于SGC-7901/R细胞对不同药物抵抗的机制不同，Tetrac可能对多种药物抵抗途径均有调节作用。本研究结果显示：Tetrac对细胞内P-gp、SOD和GST表达无明显影响，但在加用Tetrac后细胞内聚集的放射性Dox明显增加，说明Tetrac可抑制P-gp的活性功能。而药物转运子P-gp的过表达是抵抗拓扑异构酶抑制剂(如Dox和Etop)的标志，间接证明了体内激素平衡调节肿瘤对化疗药物反应性的重要作用，同时反映了Tetrac在抑制药物抵抗性肿瘤细胞方面的潜力。本研究结果显示：Tetrac可增强SGC-7901/R细胞对Dox、Cisp和Etop的敏感性，但细胞数量减少的机制仍然不明。Tetrac和Dox联合处理的SGC-7901/R细胞中，β-半乳糖苷酶和烟酸已可碱阳性细胞明显增加，表明Tetrac可通过强迫肿瘤发生衰老或凋亡来逆转肿瘤的耐药性。但对于大多数实体性肿瘤，对化疗药物敏感导致的细胞不一定均会凋亡。最近研究发现：诱导细胞发生衰老的能力强弱与肿瘤细胞的结局相关，所以很可能Tetrac不仅对实体性肿瘤敏感，还可能对浸润性肿瘤和造血系统肿瘤也比较敏感。结合本研究在体内抑瘤实验中获得的明显效果，且未发现Tetrac明显的毒副作用，说明单独应用Tetrac也具有很强的抑瘤效果。单纯联用一、两个剂量很难决定是否Tetrac与Dox具有协同作用，进一步优化实验条件将有助于明确Tetrac与Dox发挥协同抑瘤效果体内所需的给药剂量。

综上所述，本研究结果证明：Tetrac具有体内和体外抗肿瘤活性。这种甲状腺激素的类似物可抑制传统方法抵抗性肿瘤细胞系的增殖。该药物除了能够抑制肿瘤血管生成之外，且无毒性，有望成为治疗多种肿瘤的新药。

[参考文献]

[1]Furuya F,Ying H,Zhao L,et al.Novel functions of thyroid hormone receptor mutants: beyond nucleus-initiated transcription [J].Steroids,2007,72(2): 171-179.

[2]Cristofanilli M,Yamamura Y,Kau SW,et al.Thyroid hormone and breast carcinoma.Primary hypothyroidism is associated with a reduced incidence of primary breast carcinoma [J].Cancer,2005,103(6): 1122-1128.

[3]Mousa SA,Bergh JJ,Dier E,et al.Tetraiodothyroacetic acid,a small molecule integrin ligand,blocks angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor [J].Angiogenesis,2008,11(2): 183-190.

[4]Bergh JJ,Lin HY,Lansing L,et al.Integrin alphaVbeta3 contains a cell surface receptor site for thyroid hormone that is linked to activation of mitogen-activated protein kinase and induction of angiogenesis [J].Endocrinology,2005,146(7): 2864-2871.

[5]O’connor R.The pharmacology of cancer resistance [J].Anticancer Res,2007,27(3A): 1267-1272.

[6]D’arezzo S,Incerpi S,Davis FB,et al.Rapid nongenomic effects of 3,5,3′-triiodo-L-thyronine on the intracellular pH of L-6 myoblasts are mediated by intracellular calcium mobilization and kinase pathways [J].Endocrinology,2004,145(12): 5694-5703.

[7]Rebbaa A,Chu F,Davis FB,et al.Novel function of the thyroid hormone analog tetraiodothyroacetic acid: a cancer chemosensitizing and anti-cancer agent [J].Angiogenesis,2008,11(3): 269-276.

[8]Hercbergs AH,Lin HY,Davis FB,et al.Radiosensitization and production of DNA double-strand breaks in U87MG brain tumor cells induced by tetraiodothyroacetic acid (tetrac) [J].Cell Cycle,2011,10(2): 352-357.

[9]Yalcin M,Dyskin E,Lansing L,et al.Tetraiodothyroacetic acid (tetrac) and nanoparticulate tetrac arrest growth of medullary carcinoma of the thyroid [J].J Clin Endocrinol Metab,2010,95(4): 1972-1980.

[10]Yalcin M,Bharali DJ,Lansing L,et al.Tetraidothyroacetic acid (tetrac) and tetrac nanoparticles inhibit growth of human renal cell carcinoma xenografts [J].Anticancer Res,2009,29(10): 3825-3831.