高羽亭，刘林华，黄明元，梁海荣，范洪学，唐焕文

(1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.广东医学院公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室，广东 东莞 523808；3.广东医学院公共卫生学院实验中心，广东 东莞 523808)

苯虽被列为确定的人类致癌物已近30年，但其仍是工业生产中重要的化工原料和溶剂。氢醌(HQ)是苯在生物体内重要的中间代谢产物，流行病学及动物实验发现：HQ慢性毒性作用靶器官为骨髓，而骨髓分为造血和基质两大系统[1]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)作为多种骨髓基质细胞的前体细胞是造血微环境的重要组成部分，是维持造血干细胞特性及归巢到骨髓所必需的[2]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]是DNA损伤引起的细胞早期应激反应的重要因子，参与许多重要的生命活动，如凋亡、转录、DNA修复、细胞死亡、染色体功能、基因组完整性和DNA甲基化等[3]。以往对HQ毒性效应的体外研究多选用肝细胞或动物的单核细胞，这些细胞与人骨髓中细胞的生物学特性有较大差异，不能反映HQ对靶器官的毒性作用，且主要研究高剂量HQ的毒效应[4-5]。本研究采用大鼠BMSCs为研究模型，探讨低剂量HQ对BMSCs生物学性状及PARP-1基因表达的影响，旨在阐明实际接触水平下HQ对骨髓的毒效应，目前国内外无相关报道。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

低糖DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(四季青，杭州)；HQ(Sigma，美国)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(凯基，南京)；Trizol Reagent(Invitrogen，美国)；逆转录试剂盒(Fementas，立陶宛)；荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒(Roche，德国);Cell Counting Kit-8试剂盒(Dojindo，日本)。

1.2 大鼠BMSCs的分离与培养

选用7 d龄Wistar乳鼠(购自南方医科大学动物研究所，SPF级，体质量约8～10 g，合格证号SCXK粤2009-0011)，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离股骨，去除骨两端，用5 mL低糖DMEM培养基，冲出骨髓于培养皿内，收集细胞，吹打制成细胞悬液，用200目过滤网过滤为单细胞悬液。以1×105L-1接种于100 mL培养瓶中，37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱培养，约8～9 d细胞接近融合时，以质量分数为0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，用血清终止消化。反复吹打瓶壁，制成单细胞悬液，按1.5×104mL-1传代，每次传代严格控制酶的量和消化时间，利用其易脱落的特点纯化。第3代以后的细胞用于转染实验。

1.3 HQ染毒剂量的选择

细胞按1×104/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，用磷酸盐缓冲液(PBS)将HQ配制成系列终浓度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μmol·L-1)进行染毒，100 μL/孔，每个剂量设5个复孔，同时设PBS对照组。分别在24、48及72 h后用Cell Counting Kit-8试剂盒检测，以细胞活力在75%以上为原则来选择HQ剂量。

1.4 细胞活力及细胞增殖实验

细胞按1×104/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，用PBS将HQ配制成系列终浓度(2.5、5.0和10.0 μmol·L-1)进行染毒，100 μL/孔，每个剂量设5个复孔，同时设PBS对照组和未染毒正常细胞对照组，即空白组。分别作用24、48和72 h后，每孔加10 μL Cell Counting Kit-8试剂，37 ℃温育1 h，用全自动酶标仪在450 nm波长处测量各孔吸光度(A)值，并计算细胞活力，细胞活力(% )=(A实验组-A空白组) /(APBS组-A空白组)×100%。以A值大小反映细胞增殖能力，A值越大，细胞增殖能力越强。

1.5 Annexin V/碘化丙啶(PI)双标法检测细胞凋亡率

细胞按4×105/孔的密度接种于 6孔板中，待细胞贴壁后，分别给予2.5、5.0及10.0 μmol·L-1HQ进行染毒，同时设PBS对照组。作用48 h后用不含EDTA的胰酶消化，用PBS洗2次，2 000 r·min-1离心5 min,收集(1～5) ×105细胞，加入500 μL结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL PI，混匀，室温避光反应5～15 min,1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 PARP-1基因mRNA表达水平检测

1.6.1 细胞总RNA提取及完整性和纯度鉴定 细胞按4×105/孔的密度接种于 6孔板中，待细胞贴壁后，分别给予2.5、5.0及10.0 μmol·L-1HQ进行染毒，同时设PBS对照组。作用48 h后使用TRIzol试剂抽提细胞总RNA。紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所得RNA纯度和完整性。质量分数为2%琼脂糖凝胶电泳显示：样品均含有28 S、18 S和5 S 3条条带，其中28 S和18 S条带清晰可见，且两者的亮度比在正常范围内，A260/280均介于1.8～2.0，表明RNA样品的完整性和纯度可用于后续实验。

1.6.2 逆转录合成cDNA 以RNA样品为模板，进行逆转录反应制备cDNA。应用M-MMV逆转录酶，每份取1 μg总RNA进行cDNA合成，取随机引物1 μL，5×buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor 1 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL，Revertaid M-MulV Reverse Transcriptase 1 μL，DEPC处理水至20 μL，42℃×60 min，70℃×5 min进行逆转录。

1.6.3 引物设计 按照目的基因的GenBank登录号检索得到基因的全长cDNA序列，利用Primer 5.0引物设计软件根据标准荧光定量PCR引物设计原则，设计PAPR-1基因的引物，然后将设计出的引物输入BLAST数据库进行同源性比较，最终得到具有特异性的引物序列。引物序列如下：PAPR-1上游PCR引物，5′-AGACCACGCACAATGCCTATGAC-3′；PARP-1下游引物，5′-GCAGTAGTTCGCACTTTTGGACAC-3′； ACTB上游PCR引物，5′-CAACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′；ACTB下游PCR引物，5′-GACCAGAGGCATACAGGGACAACA-3′；引物由上海英骏生物公司合成。

1.6.4 PARP-1的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测 反应体系：3 μL逆转录产物，10 μL Master Mix，浓度为10 μmol·L-1的上游和下游引物各0.4 μL，dH2O 6.2 μL，总共20 μL。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，58℃退火40 s，共40个循环。融解曲线显示为单峰，且峰形尖锐，说明扩增产物特异性良好，扩增过程中无引物二聚体形成，且DNA产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示为单一条带，说明引物符合qRT-PCR检测的标准。采用比较Ct值法，以管家基因ACTB为内参相对定量各实验组样品内目的基因的表达水平，计算公式为：实验组目的基因的相对表达量为2-△△Ct，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=CtPARP-1-CtACTB。每次实验每个样品设有3个平行孔，重复3次。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 HQ染毒剂量的选择

图1显示：要保证细胞活力在75%以上，染毒剂量不能超过40.0 μmol·L-1。目前国标苯水平为6.0 mg·m-3，在实际生产过程中，很难达到20.0 μmol·L-1的骨髓蓄积量。因此染毒剂量为2.5～10.0 μmol·L-1更符合实际接触水平。

图1 不同剂量HQ作用24 h后BMSCs细胞活力的变化

2.2 HQ作用下BMSCs增殖能力的变化

分别用0、2.5、5.0及10.0 μmol·L-1HQ处理BMSCs，作用24、48及72 h后，各时间点各浓度HQ均可促进细胞增殖，且随着HQ浓度增加细胞增殖能力明显提高(P<0.05)。见表1。

2.3 HQ作用下细胞凋亡率的变化

HQ作用48 h后，与PBS组比较，5.0和10.0 μmol·L-1HQ组细胞早期凋亡率及晚期凋亡率和坏死率均明显降低(P<0.05)，且晚期凋亡率和坏死率随着剂量增加而降低。见表2。

2.4 HQ作用下BMSCs中PARP-1基因表达的变化

染毒48 h后，与PBS组(1.00±0.06)比较，2.5、5.0和10.0 μmol·L-1HQ组BMSCs中PARP-1的表达量分别为对照组的(0.92±0.06)、(0.56±0.05)(P<0.05)和(0.45±0.03)倍(P<0.05)，呈逐渐下降趋势。

表1 不同剂量HQ作用不同时间后BMSCs增殖能力的变化

表2 不同剂量HQ作用48 h后BMSCs凋亡率的变化

3 讨 论

1960—2003年我国职业人群平均苯接触水平约为51.5 mg·m-3，苯接触浓度在78.8 mg·m-3以内的人群，血中HQ浓度不超过1.1 μmol·L-1。动物实验[6]显示：大鼠接触浓度为1 595 mg·m-3的苯时，血中HQ浓度不超过1.8 μmol·L-1，骨髓中HQ浓度不超过60 μmol·L-1。随着我国职业卫生标准的不断提高，目前苯作业人群骨髓中的HQ已很难达到20 μmol·L-1的蓄积量。因此选择2.5 ～10.0 μmol·L-1作为染毒剂量更符合我国目前苯的职业接触实际水平[7-8]。

间充质干细胞在骨髓中能产生多种骨髓基质细胞，构成造血微环境，并分泌多种造血相关因子及细胞外基质蛋白维持和调节造血功能。研究[9]表明：HQ可通过caspase依赖及非caspase依赖的方式以及与TNFα发生协同作用，促进造血干细胞的凋亡。刘林华等[8]报道：低剂量HQ可促进TK6淋巴母细胞增殖，HQ作用24 h后细胞凋亡率和细胞增殖指数之间的改变趋势相反。本实验结果与该报道一致，各剂量组细胞增殖水平与PBS组比较明显提高，5.0、10.0 μmol·L-1HQ组细胞与PBS组比较，无论是早期凋亡率还是晚期凋亡和坏死率都明显降低，说明低剂量HQ能抑制细胞凋亡，促进细胞的增殖。但凋亡的抑制可延长异常细胞存活，创造了不稳定基因的环境，可促进肿瘤的发生。HQ在体内何时发挥诱导凋亡，何时发生抑制凋亡的作用，可能与其作用的剂量、时间及不同受试细胞有关，与启动不同的血液毒性效应及其血液毒性表现多样性有关。

PARP-1在应对遗传毒性反应过程中发挥重要作用，如参与 DNA 损伤修复、维持基因组稳定性、调节基因转录以及细胞凋亡过程等[10]。在肿瘤的形成过程中，时常伴有PARP-1基因的失活，导致基因突变率增高、基因组稳定性下降和细胞凋亡障碍。苯暴露可导致人类白血病，HQ 是苯的重要代谢产物之一，具有强氧化性，能够引起细胞 DNA 单链断裂，导致肿瘤相关基因失活或激活。本实验结果显示：PARP-1表达量与细胞凋亡的改变趋势相同，与细胞增殖趋势相反，提示PARP-1可能参与HQ诱导的凋亡抑制和细胞增殖。刘林华等[11]研究发现：低剂量HQ处理TK6细胞48 h后，PARP-1蛋白随剂量增加呈下降趋势，并认为PARP-1启动子区的甲基化相关基因MBD2可能在HQ诱导的PARP-1蛋白下调过程中发挥一定作用。Gao等[12]发现：在F32淋巴母细胞中，苯致PARP-1 mRNA 表达水平下降与PARP-1启动子区的高甲基化有关。本实验结果虽提示PARP-1可能参与细胞的增殖和凋亡过程，但进一步的证据以及其表达水平下调的机制还有待深入研究。

[参考文献]

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[2]Simón MF,Tatyana VM,Francesca F,et al.Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche[J].Nature,2010,466(7308):829-834.

[3]Tao GH,Yang LQ,Gong CM,et al.Effect of PARP-1 deficiency on DNA damage and repair in human bronchial epithelial cells exposed to Benzo(a)pyrene[J].Mol Biol Rep,2009,36(8):2413-2422.

[4]王 强,杨跃新,黄文琪，等.氢醌致细胞凋亡及其机制的离体实验研究[J].工业卫生与职业病,2009,35(3):155-158.

[5]陈 怡,俞 康,吴建波，等.离体培养下氢醌诱导骨髓单个核细胞凋亡的研究[J].中华劳动卫生职业病杂志,2004,22(3):161-164.

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[8]刘林华,梁小虎,凌晓璇，等.低剂量氢醌对TK6淋巴母细胞生物学性状及miR-221表达影响[J].中国职业医学,2011,38(2):102-105.

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[10]Krishnakumar R,Kraus WL.The PARP side of the nucleus: molecular actions,physiological outcomes,and clinical targets [J].Mol Cell,2010,39(1): 8-24.

[11]刘林华,凌晓璇,梁海荣，等.氢醌诱导TK6细胞miR-221表达异常致PARP-1基因下调的机制[J].环境与健康杂志,2011,28(6):485-487.

[12]Gao A,Zuo X,Liu Q,et al.Methylation of PARP-1 promoter involved in the regulation of benzene -induced decrease of PARP-1 mRNA expression [J].Toxicol Lett,2010,195(2011): 114-118.