侯小涛，赵超超，邓家刚，*

（1.广西医科大学药学院，广西南宁530021；2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；3.广西中药药效研究重点实验室，广西南宁 530001）

甘蔗叶多糖除蛋白工艺研究

侯小涛1，2，3，赵超超2，邓家刚1，2，3，*

（1.广西医科大学药学院，广西南宁530021；2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；3.广西中药药效研究重点实验室，广西南宁 530001）

目的：筛选甘蔗叶多糖除蛋白的最佳工艺。方法：以蛋白质清除率、多糖保留率为指标，比较Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂法、Sevage法、三氯乙酸法（TCA法）、三氯乙酸-Sevage法清除甘蔗叶多糖中蛋白质的效果，并通过正交实验优化出最佳工艺。结果：Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂能有效纯化甘蔗叶多糖，且除蛋白最佳工艺为澄清剂用量为6%/3%（B/A），温度为30℃，多糖溶液浓度为3%，时间为1h/1h。结论：Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂能有效清除甘蔗叶多糖中的蛋白质，且澄清效果与温度和澄清剂用量有关。

甘蔗叶，天然澄清剂，多糖，除蛋白

Abstract：Objective：To select deproteinization-technology of polysaccharides in sugarcane leaf.Methods：These different ways to removing protein from polysaccharides in sugarcane leaf contain natural clarifying agents，Sevage method，TCA and TCA-Sevage method，and that were compared with the clearance rate of protein and the polysaccharide retention as indexes，and the technology was optimized by orthogonal experiment.Results：TypeⅡZTC1+1 natural clarifying agents could effectively purify sugarcane leaf polysaccharides，and the optimum condition of deproteinization with typeⅡZTC1+1 natural clarifying agents were as follows：the adding amount of natural clarifying agents（i.e B and A） were 6%and 3%respectively，the clarifying temperature was 30℃，concentration of polysaccharides was 3%（m/v），the clarifying time（i.e B and A） were 1h and 1h respectively.Conclusion：TypeⅡZTC1+1 natural clarifying agents could effectively remove protein of sugarcane leaf polysaccharides，which was relatived to the amount of clarifying agents and temprature.

Key words：sugarcane leaf；natural clarifying agents；polysaccharides；deproteinization

甘蔗叶是禾本科植物甘蔗Saccharum sinensis Roxb.的叶。甘蔗广泛种植于热带、亚热带地区，全世界有100多个国家种植甘蔗，中国蔗区主要分布在广西、广东等地。甘蔗叶作为甘蔗丰收后的副产品，每年产量颇高，却未得到充分利用，除少部分作为动物饲料外，大部分被蔗农就地焚烧，造成资源浪费、污染环境。另外，中药资源面临着严峻的可持续发展问题，对这样既有药用价值同时又是农作物的资源进行研究，发现其新用途，对于资源保护和开发具有重要意义。据报道，甘蔗叶含有大量叶绿素、氨基酸、多糖和黄酮等物质，其嫩叶和蔗梢含过氧化物酶等物质，具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗肿瘤[1-6]等药理作用。甘蔗叶多糖为甘蔗叶的有效成分，但世界范围内对其研究极少，仅见一般提取工艺研究的报道[2]。目前多糖的提取多采用水提醇沉法，水提液经醇沉处理时，沉淀中除含有多糖类物质，同时还含蛋白质等杂质，影响多糖的纯度，因此有待进一步纯化，除去多糖中蛋白质等杂质。Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂是从食品中提取的天然高分子物质，是替代聚丙烯酰胺、聚合铝等人工合成絮凝剂的理想品种。它主要用于除去鞣质、蛋白质、树胶、蜡质等胶体不稳定成分，而中药有效成分如黄酮、生物碱、皂苷类、苷类、萜类、多糖、氨基酸、多肽、矿物质等小分子物质不受影响[7]。本实验以多糖保留率和蛋白质清除率为指标，比较研究天然澄清剂法、Sevage法、三氯乙酸法（TCA法）、三氯乙酸-Sevage法等4种不同除蛋白方法，并采用正交实验法优选Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂除蛋白的工艺，期望制备出高纯度的甘蔗叶多糖，为后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘蔗叶（新台糖22号） 采集于广西甘蔗研究所，经该所许树宁高级农艺师鉴定为禾本科甘蔗属植物甘蔗（Saccharum sinensis Roxb.）的叶；Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂 由A剂和B剂组成，从食品中提取的天然高分子物质，天津振天成科技有限公司；D-无水葡萄糖标准品 中国药品生物制品检定所，批号：110833-200503；牛血清白蛋白标准品 Sigma；考马斯亮蓝G-250 上海源叶生物科技有限公司；苯酚、浓硫酸、三氯乙酸（TCA）、氯仿、正丁醇 均为国产分析纯。

UV-160A紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；SartoriusBP211D电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；HHS4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；LDZ4-1.2离心机 北京医用离心机厂；B3500SMT超声波清洗器 必能信超声上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘蔗叶多糖的制备 取甘蔗叶粗粉335kg，置于1t提取罐中，加30倍量纯水于100℃浸提3次，每次2h，过滤，合并滤液，并浓缩至饱和状态，加无水乙醇至浓度达到80%，静置12h，离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤数次，抽滤，真空干燥后得甘蔗叶粗多糖粉末。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的制备 称取干燥至恒重的葡萄糖标准品25.30mg，置于25mL容量瓶中，加蒸馏水溶解、稀释至刻度，配制成质量浓度为1.012mg/mL的母液。精密吸取母液5.0mL置100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度作为贮备液，吸取贮备液2.0mL，苯酚-硫酸法[8]显色，在400～800nm波长范围内扫描光谱，确定λmax。然后精密吸取贮备液1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mL分别置于具塞试管中，加蒸馏水补至2.0mL，苯酚-硫酸法显色，另以蒸馏水2.0mL同上操作作为空白对照，于λmax处测定吸光度，绘制标准曲线，求出回归方程。

1.2.3 蛋白质标准曲线的制备 称取干燥至恒重的牛血清白蛋白标准品12.44mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，稀释至刻度，配制成质量浓度为124.4μg/mL的贮备液。吸取贮备液1.0mL，根据考马斯亮蓝G-250法[9]（考马斯亮蓝试剂配制参照李如亮[10]的方法），在400～800nm波长范围内扫描光谱，确定λmax。然后吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL贮备液，加蒸馏水补至1.0mL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，摇匀，以蒸馏水为空白，10min后于λmax处测定吸光度，绘制标准曲线，求出回归方程。

1.2.4 色素表征吸收[11]取甘蔗叶多糖配成适宜浓度的溶液，在400～800nm波长范围内进行扫描，确定色素表征吸收。

1.2.5 除蛋白方法比较

1.2.5.1 多糖溶液的配制 称取甘蔗叶粗多糖10g，加入200mL蒸馏水超声溶解，离心，配制质量浓度为5%的甘蔗叶多糖溶液，备用。

1.2.5.2 澄清剂的配制 根据Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂说明书所示，配制方法如下：

A组分：称取澄清剂A组分1g，用10mL蒸馏水溶解，并搅拌成糊状，再加入剩余90mL蒸馏水，不断搅拌，使其充分溶解，溶胀24h，配成1%黏胶液（用前摇匀）100mL，即得。

B组分：先配制1%醋酸（v/v），称取澄清剂B组分1g，用10mL 1%醋酸溶解，并搅拌成糊状，加入余下的90mL 1%醋酸，充分搅拌使其溶解，溶胀24h，配成1%黏胶液（用前摇匀）100mL，即得。

1.2.5.3 Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂法 取5%甘蔗叶多糖溶液，按澄清剂用量（B/A）为8%/4%，在60℃下，保温2h/1h（每隔半小时搅匀一次），过滤，定容，分别测定多糖、蛋白质含量。

1.2.5.4 TCA法 取5%甘蔗叶多糖溶液，按体积比为1∶1的比例，加入10%三氯乙酸溶液，充分振摇，置于4℃冰箱，静置2h，离心，上清液用5%NaOH中和，定容，分别测定多糖、蛋白质含量。

1.2.5.5 Sevage法 取5%甘蔗叶多糖溶液，按照多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1（v∶v∶v）的比例，先后加入氯仿、正丁醇，剧烈振摇15min，待其静置分层，得上层水层，同上操作，重复6次实验，离心，取上清液定容，分别测定多糖、蛋白质含量。

1.2.5.6 TCA Sevage法 取5%甘蔗叶多糖溶液，先按照体积比为1∶1的比例，加入10%三氯乙酸溶液，充分振摇，置于4℃冰箱，静置2h，离心，上清液用5%NaOH中和，然后按多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1（v∶v∶v）的比例，先后加入氯仿、正丁醇，剧烈振摇15min，离心，取上清液定容，分别测定多糖、蛋白质含量。

1.2.6 单因素实验

1.2.6.1 澄清剂用量对除蛋白效果的影响 固定多糖溶液浓度为5%，温度为60℃，时间2/1（B/A，h/h），分别加入澄清剂，用量（B/A）为4%/2%、6%/3%、8%/4%、10%/5%，进行澄清处理。

1.2.6.2 温度对除蛋白效果的影响 固定多糖溶液浓度为5%，澄清剂用量（B/A）为6%/3%，时间2/1（B/A，h/h），分别在温度为20、40、60、80℃条件下进行澄清处理。

1.2.6.3 多糖浓度对除蛋白效果的影响 固定温度为40℃，澄清剂用量（B/A）为6%/3%，时间2/1（B/A，h/h），分别取浓度为2%、4%、6%、8%、10%的甘蔗叶多糖溶液进行澄清处理。

1.2.6.4 时间对除蛋白效果的影响 固定多糖浓度为2%，澄清剂用量（B/A）为6%/3%，温度为40℃，在保温时间分别为0.5/0.5、0.5/1、1/1、2/1、2/2（B/A，h/h）的条件下进行澄清处理。

1.2.7 样品溶液测定 精密吸取除蛋白前后的多糖溶液，根据标准工作曲线下方法分别测定多糖、蛋白质含量和色素A400。

1.2.8 指标的确定 以多糖保留率、蛋白质清除率和脱色率为考察指标，兼顾多糖保留率（权值为0.4）、蛋白质清除率（权值为0.5）和脱色率（权值为0.1），采用加权法进行综合评分。多糖保留率（%）=M2/M1×100；蛋白质清除率（%）=（N1-N2）/N1×100；脱色率（%）=（A1-A2）/A1×100；综合评分=0.1×脱色率+0.4×多糖保留率+0.5×蛋白质清除率（式中，M1、M2分别为处理前后的多糖含量；N1、N2分别为处理前后的蛋白质的含量；A1、A2分别为处理前后色素A400）。

1.2.9 正交实验因素水平表 选择澄清剂用量、温度、多糖浓度、时间四个因素，按L9（34）安排正交实验，因素水平表见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.3 验证实验

为考察工艺的稳定性，配制质量浓度为3%的多糖溶液三份，根据最佳工艺条件处理后，分别测定的多糖、蛋白质含量和色素表征吸收，计算出多糖保留率、蛋白质清除率、脱色率及RSD。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

吸取葡萄糖贮备液，显色后进行光谱扫描，如图1所示，确定λmax为487nm。以葡萄糖浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A487为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A487=0.0133C+0.0136，r=0.9956，表明葡萄糖浓度在25.30～50.60μg/mL范围内，具有良好的线性关系（见图2）。

图1 葡萄糖扫描光谱图Fig.1 Glucose by visible wavelength

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 The standard curve of glucose

2.2 蛋白质标准曲线

吸取牛血清白蛋白贮备液，显色后进行光谱扫描，如图3所示，确定λmax为593nm。以牛血清白蛋白浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A593为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=0.0055C+0.0396，r=0.9992，表明牛血清白蛋白浓度在24.88～124.4μg/mL范围内，呈良好的线性关系（见图4）。

图3 蛋白质扫描光谱图Fig.3 Protein by visible wavelength

图4 蛋白质标准曲线Fig.4 The standard curve of protein

2.3 色素表征吸收

将多糖溶液在400～800nm波长范围内进行扫描，如图5所示，由此选择400nm处吸光值（A400）表征色素含量。

图5 多糖溶液扫描光谱图Fig.5 Polysaccharides solution by visible wavelength

2.4 除蛋白效果比较

如表2所示，甘蔗叶多糖采用Sevage法除蛋白，反复处理6次后多糖损失相对较少，蛋白质的清除率较高，该法条件温和，在避免多糖降解方面有较好效果，但该法效率低，且需消耗大量有毒有机试剂，易残留；三氯乙酸法除蛋白效果明显，与Sevage法相比，多糖损失相差不大，但由于其酸性较强，容易导致多糖的降解；天然澄清剂在除蛋白过程中优势明显，多糖损失少，蛋白质清除率相对较高，且经过澄清处理后的多糖溶液具有颜色浅、易过滤、无残留的特点。故本实验选用Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂用于去除甘蔗叶多糖中蛋白质，并通过正交实验优化其除蛋白工艺。

表2 除蛋白效果比较（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effec（t±s，n=3）

表2 除蛋白效果比较（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effec（t±s，n=3）

指标 Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂法 TCA法 Sevage法 TCA-Sevage法除蛋白次数 1 1 6 1多糖保留率（%） 95.77±0.11 71.80±0.05 77.27±0.15 92.06±0.14蛋白质清除率（%） 56.92±0.15 59.01±0.11 43.06±0.11 17.67±0.12

2.5 除蛋白单因素实验结果

2.5.1 澄清剂用量对除蛋白效果的影响 如图6所示，随着澄清剂用量的增加，除蛋白效果呈现先升后降的趋势，说明澄清剂用量并非越大越好，可能是澄清剂体系内高分子与蛋白质结合已经达到饱和，剩余澄清剂产生的絮凝物吸附作用使多糖损失增加。

图6 澄清剂用量对除蛋白效果的影响Fig.6 Effect of the amount of clarifying agents on deproteinization effect

2.5.2 温度对除蛋白效果的影响 如图7所示，随着温度的升高，澄清剂除蛋白效果趋势先升后降，可能是因为温度低，澄清剂体系内粒子热运动不剧烈，絮凝作用不充分，效果差；温度过高，澄清剂体系内高分子活性受限制，影响絮凝作用。

图7 温度对除蛋白效果的影响Fig.7 Effect of temperature on deproteinization effect

2.5.3 多糖浓度对除蛋白效果的影响 从图8可以看出，随着多糖浓度增加，澄清剂除蛋白效果呈现下降的趋势，可能是由于多糖浓度过大，使得澄清剂在药液中分散不均匀，且浓的药液在澄清时所产生的大量絮凝物可能会夹杂目标成分，从而影响有效成分含量。

2.5.4 时间对除蛋白效果的影响 从图9可以得知，随着澄清时间延长，综合评分并没有显著上升，且基本保持在75%以上，待2h后有所下降，可能是由于澄清剂产生的絮凝物长时间吸附作用，影响澄清效果。根据澄清剂说明书所示，加入澄清剂后保温1～2h即可。

图8 多糖浓度对除蛋白效果的影响Fig.8 Effect of polysaccharides concentration on deproteinization effect

图9 时间对除蛋白效果的影响Fig.9 Effect of time on deproteinization effect

2.6 正交实验结果分析

由表3可知，各因素对脱色率和多糖保留率的影响顺序为：B＞A＞C＞D；对蛋白质清除率的影响顺序为：B＞C＞A＞D。

由表4可知，以多糖保留率为指标，温度对多糖保留率有显著影响，澄清剂用量有一定影响，其他因素几乎没有影响；以脱色率和蛋白质清除率为指标，温度对溶液澄清度和蛋白质清除率都有显著影响，其他因素几乎没有影响。温度是具有显著影响的因素，故选择反应温度为30℃；澄清剂用量是有一定影响的因素，根据直观分析结果，结合本实验研究目的，选择澄清剂用量为6%/3%；多糖浓度和时间是几乎没有影响的因素，以综合评分为指标，根据极差分析结果，选择多糖浓度为3%；从节约能源、提高效率的角度出发，选择处理时间为1/1（h/h）；故筛选出最佳工艺：配制质量浓度为3%的多糖溶液，在温度为30℃、澄清剂用量为6%/3%的条件下，加入B组分加热1h，然后加入A组分加热1h。

2.7 验证实验结果

验证实验结果如表5所示，在该工艺条件下，各指标RSD均小于3%，说明该工艺稳定、可行。

3 结论

比较几种脱蛋白方法可知，Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂清除蛋白效果最佳，且多糖损失少、色泽浅，蛋白质清除率较高，且经过处理后的多糖溶液清澈透亮、色泽浅、易过滤、无异味。采用正交实验优化除蛋白工艺为澄清剂用量为6%/3%（B/A），温度为30℃，多糖溶液浓度为3%，时间为1/1（h/h）。在该工艺条件下，多糖保留率平均为88.38%，蛋白质清除率平均为71.21%，脱色率平均为58.30%，综合评分平均为76.79%，RSD均小于3%，说明该工艺稳定、可行。可见，Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂能有效纯化甘蔗叶多糖。

表3 L（934）正交试验结果（±s，n=3）Table 3Results of L（934）orthogonal test（±s，n=3）

表3 L（934）正交试验结果（±s，n=3）Table 3Results of L（934）orthogonal test（±s，n=3）

实验号 A B C D 脱色率（%） 多糖保留率（%） 蛋白质清除率（%） 综合评分（%）1 1 1 1 1 51.33±0.02 90.77±0.18 61.52±0.09 72.20±0.09 2 1 2 2 2 53.01±0.04 84.88±0.15 66.91±0.19 72.71±0.04 3 1 3 3 3 49.34±0.02 89.29±0.12 59.82±0.03 70.56±0.06 4 3 57.34±0.02 89.11±0.13 68.81±0.04 75.78±0.04 5 2 2 3 1 54.98±0.02 84.53±0.14 65.86±0.06 72.24±0.09 2 1 2 6 2 59.34±0.08 88.12±0.15 69.45±0.08 75.91±0.09 7 3 1 3 2 53.30±0.02 83.63±0.13 62.56±0.17 70.06±0.05 8 3 2 1 3 65.54±0.07 82.65±0.12 66.98±0.10 73.10±0.05 2 3 1 9 3 3 2 1 61.75±0.02 81.41±0.16 70.92±0.15 74.20±0.09 K1 153.68 284.88 176.21 168.06 K2 171.66 173.53 172.10 165.65 K3 180.59 170.43 157.62 172.22 R 26.91 114.45 18.59 6.57 K′1 264.94 441.42 261.54 256.71 K′2 261.76 252.06 255.40 256.63 K′3 247.69 258.82 257.45 261.05 R′ 17.25 189.36 6.14 4.42 K″1 188.25 328.28 197.95 198.30 K″2 204.12 199.75 206.64 198.92 K″3 200.46 200.19 188.24 195.61 R″ 15.87 128.53 18.40 3.31 K‴1 215.47 369.19 221.21 218.64 K‴2 223.93 218.05 222.69 218.68 K‴3 217.36 220.67 212.86 219.44 R‴ 8.46 151.14 9.83 0.80

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

在纯化工艺中，温度对澄清剂有显著影响，可能是温度对体系内粒子热运动、高分子生物活性有影响[12]，从而影响其絮凝作用。澄清剂用量对除杂效果有一定影响，一定范围内澄清剂用量越大，溶液越澄清，蛋白质含量越低，但是多糖也会相应减少，故需要合理选择澄清剂的用量。有关多指标优选Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂用于甘蔗叶多糖纯化工艺研究还未见报道，因此本实验对絮凝技术应用于甘蔗叶多糖的纯化有一定指导意义，同时为制备高纯度甘蔗叶多糖提供技术支持。

表5 验证实验结果Table 5 Results of process verification

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Study on deproteinization-technology of polysaccharides in sugarcane leaf

HOU Xiao-tao1，2，3，ZHAO Chao-chao2，DENG Jia-gang1，2，3，*
（1.School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.School of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China；3.Guangxi Key Laboratory of Pharmacodynamic Studies of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）20-0240-06

2012-04-24 *通讯联系人

侯小涛（1969-），女，博士，教授，主要从事中药活性成分及质量控制方面的研究。

广西壮族自治区中医药管理局中医药科技专项（GZKZ09-9）；广西科技厅技术研究与开发项目（桂科攻10124008-11）。