李德海，王振宇，2，*，周亚嫌

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学食品与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

红皮云杉多酚的提取及其抗氧化活性研究

李德海1，王振宇1，2，*，周亚嫌1

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学食品与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

以红皮云杉球果为原料，采用溶剂浸提法，通过单因素实验及正交实验，研究了料液比、乙醇浓度、提取温度及提取时间对红皮云杉球果多酚类化合物提取的影响，并考察了红皮云杉球果多酚的总抗氧化性、清除羟基自由基的能力、清除超氧阴离子的能力以及清除DPPH·的能力。结果表明，红皮云杉球果多酚的最佳提取工艺条件为：液料比25∶1，乙醇浓度60%，提取温度60℃，提取时间3h，红皮云杉球果多酚提取量为136.3mg/g。在此条件下提取的红皮云杉球果多酚，对于ABTS+·、OH·、DPPH·和O2-·都具有较好的清除作用，且均强于VC和BHA。

红皮云杉，多酚，提取，抗氧化活性

Abstract：The paper utilized solvent to extract polyphenols from Picea Koraiensis Nakai pinecone.The effect of ratio of material to liquid，alcohol concentration，extraction temperature and extraction time on the polyphenol yield was researched by single factor experiment and orthogonal test.At the same time，the ability of total antioxidition，the ability to eliminating OH·，DPPH·and O2-· were investigated.The result showed that the optimum extraction condition of polyphenols was as the following：the ration of liquid to material was 25∶1，alcohol concentration was 60%，the extraction temperature was 60℃，the extraction time was 3h，the yield of polyphenols extraction from Picea Koraiensis Nakai pinecone was 136.3mg/g.The polyphenol extraction from Picea Koraiensis Nakai pinecone had good eliminating effect on ABTS+·，OH·，DPPH·and O2-·，that was better than VCand BHA.

Key words：Picea Koraiensis Nakai；polyphenol；extraction；antioxidition

近年来，国内外对于植物多酚类化合物的研究非常多，植物多酚具有较强的抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老和抑制胆固醇上升等活性，适量摄入植物多酚能够有效地预防某些疾病[1]。研究表明，松科（Pinaceae）植物的球果、树皮及种子壳中含有大量的多酚类化合物，具有优良的抗氧化[2]、抗病毒及抗菌等生物活性[3-4]。因此，松多酚成为研究学者研究开发的热点。红皮云杉（Picea koraiensis）是重要的松科植物，属于常绿乔木，适应性较强，生长速度快，主要分布于我国东北大、小兴安岭，吉林长白山区等地，为我国云杉属中分布较广的树种之一[5]。目前，对红皮云杉球果中多酚类成分提取及其抗氧化活性的研究尚未见报道。本文利用溶剂法对红皮云杉球果中的多酚进行了提取，并优化了提取工艺参数，同时利用ABTS试剂盒、水杨酸体系、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）体系及邻苯三酚体系测定红皮云杉多酚的抗氧化活性，为开发具有防御自由基相关疾病的天然抗氧化剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红皮云杉球果 采集于伊春地区，常温下干燥后粉碎，过60目筛，备用；Folin-酚试剂，没食子酸，碳酸钠，1，1-二苯基-2-苦味酰基苯肼（DPPH），总抗氧化活性试剂盒（ABTS），抗坏血酸（VC），丁基羟基茴香醚（BHA），邻二氮菲，硫酸亚铁，PBS缓冲液，双氧水，无水乙醇。

紫外可见分光光度计TU-1800 北京普析通用仪器有限责任公司；高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器公司；R-205B旋转蒸发仪 上海申胜仪器公司；电子天平，恒温水浴锅 北京医疗电子仪器厂。

1.2 红皮云杉球果中多酚类化合物的提取

采用溶剂法提取红皮云杉球果中多酚类化合物，准确称取2.0g红皮云杉球果粗粉置于三角瓶中，以一定浓度乙醇溶液作为溶剂，分别按照一定的料液比、温度、浸提时间，于4000r/min离心10min，取上清液抽滤，收集滤液即得红皮云杉多酚提取液。取红皮云杉多酚提取液并适当稀释，用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚提取量。

1.3 正交实验

选用乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等4个因素做单因素实验，确定各因素的适合范围。在单因素实验基础上，采用正交实验设计模型，选用乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素为自变量，以红皮云杉球果多酚提取量为考察指标，设计三因素三水平L9（34）正交实验，分析因素与水平设计实验因素与水平编码表见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

1.4 红皮云杉球多酚提取量的测定

1.4.1 标准曲线的绘制 采用Folin-Ciocalteu比色法[6]测定红皮云杉球多酚提取量，准确吸取100mg/L的没食子酸标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶内，分别加入Folin-酚试剂1mL，充分振荡后加入1mol/L Na2CO3溶液5mL，摇匀后50℃水浴5min，冷却后于760nm下测定吸光度。以没食子酸总酚含量为X轴，以吸光度为Y轴。以含量对吸光度进行直线回归，得标准曲线方程方程：Y=0.1493X-0.0010，R2=0.9988。

1.4.2 红皮云杉多酚提取量的测定 取1mL稀释后的球果多酚提取液，加入Folin-酚试剂1mL，充分振荡后加入1mol/L Na2CO3溶液5mL，摇匀后50℃水浴5min，冷却后于760nm下测定吸光度。将吸光度带入标准曲线方程计算样品中多酚类化合物的提取量。

1.5 红皮云杉多酚抗氧化活性研究

1.5.1 总抗氧化活性的测定 采用ABTS法测定红皮云杉多酚的总抗氧化活性，分别将提取物配制成一系列浓度的溶液。在96孔板中加依次入20μL过氧化物酶液，10μL待测液，170μL ABTS工作液，摇匀，温育6min，在405nm波长处测定其吸光度。以溶剂乙醇代替待测液作空白对照，测定吸光度，按下式计算：

式中：A1为加入待测液的吸光度，A为空白对照的吸光度。以VC、BHA溶液作为对照。

1.5.2 清除羟自由基（·OH）能力测定 参照文献[7]的方法稍作修改，分别将提取物配制成一系列浓度的溶液。在试管中依次加入6mmol/L的FeSO4溶液1mL、6mmol/L的H2O2溶液1mL和待测溶液1mL，摇匀，静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸溶液1mL，摇匀，静置30min后于510nm波长处测其吸光度。以乙醇溶液代替待测液作空白对照，测定吸光度。以VC、BHA溶液代替样品作为阳性对照。按下式计算清除率：

式中：A为空白对照的吸光度；A0为无水杨酸时加入待测液的吸光度；A1为加入待测液的吸光度。

1.5.3 清除DPPH自由基能力测定 参照文献[8]的方法稍作修改，分别将提取物配制成一系列浓度的溶液，在试管中加入2mL 1×10-4mol/L的DPPH·溶液（用无水乙醇配制），之后再加入1mL待测液，摇匀，避光反应30min后于517nm处测定吸光值，以2.0mL无水乙醇与1.0mL待测液作参比，测定吸光值，同时以1mL溶剂乙醇溶液和2mL DPPH·溶液作为空白对照测定吸光度值。以VC、BHA溶液代替样品作为阳性对照。清除率计算公式：

式中：A1为加入待测液的吸光度；A0为无DPPH·加入时的吸光度；A为空白对照的吸光度。

1.5.4 清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力的测定参照文献方法[9]稍作修改，分别将提取物配制成一系列浓度的溶液。取pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL于试管中，25℃水浴中保温10min，加入不同浓度待测液1mL，混匀后加入1mL在37℃水浴中预热的邻苯三酚（用10mmol/L盐酸配制），在37℃水浴中准确反应10min，立即用6mol/L盐酸3滴终止反应，在320nm下测其吸光度。以乙醇溶液代替待测液作为空白对照，测定吸光度。以10mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液作为参比，测定吸光度。以VC、BHA溶液代替样品作为阳性对照。清除率公式：

式中：A为空白对照的吸光度；A1为加入待测液的吸光度；A0为无邻苯三酚加入时的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验及其分析

2.1.1 液料比对多酚提取量的影响 以60%的乙醇溶液作为溶剂，分别按照料液比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（g/mL），50℃水浴浸提60min，然后4000r/min离心10min后取上清液抽滤，定容并稀释，考察液料比对红皮云杉多酚提取量的影响，实验结果如图1所示。

图1 液料比对多酚提取量的影响Fig.1 Effect of ratio of liquid to material on polyphenols yield

从图1中可以看出，红皮云杉多酚提取量随着料液比的增大而提高，其中液料比从5∶1变化到25∶1时，多酚提取量的提高最为明显，而料液比在25∶1～35∶1的变化中，多酚提取量的上升趋势明显减弱，因此综合经济因素考虑，确定最佳液料比为25∶1。

2.1.2 乙醇浓度对多酚提取量的影响 分别用0、20%、40%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液，按照25∶1液料比，50℃水浴浸提60min，然后4000r/min离心10min后取上清液抽滤，定容并稀释，考察乙醇浓度对红皮云杉多酚提取量的影响，实验结果如图2所示。

图2 乙醇浓度对多酚提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenols yield

从图2中可以看出，乙醇浓度为50%时，多酚的提取量最大，乙醇浓度大于或者小于50%都会导致多酚提取量下降。可能因为部分多酚属于水溶性物质，所以溶剂浓度偏大或者偏小都会影响总酚提取量。根据这一实验结果，可确定最佳提取溶剂浓度为50%。

2.1.3 提取温度对多酚提取量的影响 以50%的乙醇溶液作为溶剂，按照液料比25∶1，分别在30、40、50、60、70、80、90℃下水浴浸提60min，然后4000r/min离心10min后取上清液抽滤，定容并稀释。取适量稀释后的提取液，考察提取温度对红皮云杉多酚提取量的影响，实验结果如图3所示。

图3 提取温度对多酚提取量的影响Fig.3 Effect of extract temperature on polyphenols yield

从图3中可以看出，提取温度在30～50℃范围内，多酚提取量处于上升趋势，这是由于温度越高，分子运动越强烈，多酚类物质更容易溶出。但在提取温度高于50℃的范围里，多酚提取量呈下降趋势，这可能是由于过高的温度会导致多酚类物质分解而造成，因此，可以确定最佳的提取温度为50℃。

2.1.4 提取时间对多酚提取量的影响 以50%的乙醇溶液作为溶剂，按照液料比25∶1，在50℃温度下，分别反应1、2、3、4、5、6h，然后4000r/min离心10min后取上清液抽滤，定容并稀释，考察提取时间对红皮云杉多酚提取量的影响，实验结果如图4所示。

图4 提取时间对多酚提取量的影响Fig.4 Effect of extract time on polyphenols yield

从图4中可以看出，提取时间在240min内，随着时间的增加，多酚提取量也有所提高，这可能是因为在一定的时间范围内，时间越长，多酚类物质溶出得越多。但当提取时间超过240min，多酚提取量基本持平，这可能是由于其他因素的限制，导致多酚无法再更多地溶出。

2.2 正交实验结果

对红皮云杉球果多酚提取条件进行优化，实验结果如表2所示。

表2 正交实验结果及极差分析表Table 2 The results and range analysis of the orthogonal test

从表2实验结果可以看出，A3B2C3D1为最佳工艺参数，在此条件下，最佳工艺参数为乙醇浓度为60%、液料比为25∶1、提取温度为60℃、提取时间为3h。根据对红皮云杉球果多酚提取量（RB＞RA＞RC＞RD）的极差分析，乙醇浓度是影响红皮云杉球果多酚提取量的第一因素，液料比为为第二因素，而提取时间和提取温度对红皮云杉球果多酚提取量的影响较小。

在此条件下，进行验证实验，结果红皮云杉球果多酚提取量为136.3mg/g，均高于表2中的其他组合，说明此工艺可行。

2.3 总抗氧化活性分析

本实验以天然抗氧化剂VC和人工合成的抗氧化剂BHA作为对照，评价红皮云杉球果多酚的总抗氧化活性，实验结果见图5。

图5 红皮云杉球果多酚、VC及BHA对ABTS+·的清除作用Fig.5 The ABTS+·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

从图5中可以看出，VC、BHA和红皮云杉球果多酚对ABTS+·都有清除作用，其中红皮云杉球果多酚和VC随着浓度的增加，对ABTS+·清除率显著增加，表明红皮云杉球果多酚和VC对ABTS+·清除效果非常明显，而BHA随着浓度的增加，对ABTS+·清除率增加不显著，而且其对ABTS+·清除率也比较低，表明BHA对ABTS+·清除效果不明显。综合对比表明，红皮云杉球果多酚对ABTS+·有较好的清除作用。

2.4 清除羟自由基（·OH）能力

本实验以天然抗氧化剂VC和人工合成的抗氧化剂BHA作为对照，评价红皮云杉球果多酚清除羟自由基（·OH）的能力，实验结果见图6。

图6 红皮云杉球果多酚、VC及BHA对OH·的清除作用Fig.6 The OH·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

从图6中可以看出，红皮云杉球果多酚和VC对·OH都有较明显的清除作用，红皮云杉球果多酚和VC随着浓度的增加，对·OH清除率显著增加，表明红皮云杉球果多酚和VC对·OH清除效果非常明显，从图6中还可以看出，红皮云杉球果多酚对·OH清除率明显高于VC。BHA对·OH的清除率很低，而且清除率几乎不随浓度的变化而改变。综合对比表明，红皮云杉球果多酚对·OH有较好的清除作用。

2.5 清除DPPH·能力

本实验以天然抗氧化剂VC和人工合成的抗氧化剂BHA作为对照，评价红皮云杉球果多酚清除DPPH·的能力，实验结果见图7。

从图7中可以看出，VC、BHA和红皮云杉球果多酚对DPPH·都有清除作用，其中红皮云杉球果多酚和VC随着浓度的增加，对DPPH·清除率有一定程度增加，表明红皮云杉球果多酚和VC对DPPH·清除效果明显，而BHA随着浓度的增加，对DPPH·清除率几乎不增加，而且对DPPH·清除率也比较低，表明BHA对DPPH·清除效果不明显。综合对比表明，红皮云杉球果多酚对DPPH·有较好的清除作用。

图7 红皮云杉球果多酚、VC及BHA对DPPH·的清除作用Fig.7 The DPPH·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

2.6 清除超氧阴离子自由基作用

本实验以天然抗氧化剂VC和人工合成的抗氧化剂BHA作为对照，评价红皮云杉球果多酚清除超氧阴离子的能力，实验结果见图8。

图8 红皮云杉球果多酚、VC及BHA对O2-·的清除作用Fig.8 The O2-·scavenging activity of polyphenols，VCand BHA

从图8可以看出，VC、BHA和红皮云杉球果多酚都能有效清除超氧阴离子自由基，其中红皮云杉球果提取物即松多酚的清除率最高，其次是VC，最后是BHA，且红皮云杉球果提取物和VC随浓度的上升提取量都有较为明显的增加，而BHA的清除率随浓度上升的变化幅度并不明显。

3 结论

3.1 通过单因素实验和正交实验优化得到红皮云杉球果中松多酚的最佳提取工艺条件为：液料比25∶1，乙醇浓度60%，提取温度60℃，提取时间180min。在最佳工艺下，多酚提取量达到136.3mg/g球果。由此结果可以看出，对红皮云杉球果中松多酚的研究是具有很大前景的。

3.2 根据对红皮云杉球果中提取的松多酚的总抗氧化性、清除羟基自由基能力、清除DPPH·能力以及清除超氧阴离子自由基能力的测定，可以得知红皮云杉球果中提取的松多酚具有较强的抗氧化性，并且在与天然抗氧化剂VC和人工合成抗氧化剂BHA的比较中，占有明显的优势。鉴于氧化伤害是人体多种疾病和衰老的主要源头所在，对于红皮云杉球果中松多酚的研究，必然会对人类健康产生巨大的积极作用，可以说红皮云杉球果中的松多酚是一种极具潜力的天然抗氧化剂。

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Study on the extraction conditions and antioxidition of polyphenol from Picea Koraiensis Nakai

LI De-hai1，WANG Zhen-yu1，2，*，ZHOU Ya-xian1
（1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）20-0206-05

2012-05-16 *通讯联系人

李德海（1976-），男，博士，讲师，研究方向：食品化学及植物有效成分。

国家自然科学基金资助项目（31170510）。