唐愈菲 朱翠明

邵阳地区肺炎支原体大环内酯类耐药株的研究

唐愈菲 朱翠明

目的 了解邵阳市肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药的情况。方法 收集2009～2011年邵阳地区感染肺炎支原体的患者的Mp（Mycoplasma pneumonia）临床株，药敏实验初步筛选对大环内酯类抗生素耐药株，并通过提取耐药株DNA，PCR扩增及基因测序鉴定突变发生的情况。结果共收集134支临床肺炎支原体株，筛选出的12支临床耐药株中有4株发生了突变（占8.2%）突变为：A2063G，此突变在其他国家的相关研究中也经常发生。结论 长期使用大环内酯类抗生素可引起Mp耐药并引起基因突变的情况发生，对此应该引起临床在用药方面的重视。

肺炎支原体；大环内酯类耐药；

肺炎支原体是呼吸道传播的病原体，在引起社区获得肺炎的病原体中有10%～40%的为肺炎支原体。社区获得性肺炎具有自限性，通常持续数周便自愈，但有时也可引起严重的肺炎。大环内酯类抗生素一直为支原体肺炎临床常用药物，但是自2000年以来，以日本为主的报道发现对大环内酯类抗生素耐药的肺炎支原体株的数量在逐年上升。而研究发现耐药株引起的肺炎通常较敏感株治疗困难。

1 资料和方法

1.1 一般资料 共陆续收集2009～2011年期间邵阳地区3150株上呼吸道感染的临床株，使用支原体快速诊断试剂盒发现其中有134株为肺炎支原体感染。其中55～75岁的患者有56株占41.79%。0～4岁47株占35.07%。每发现支原体感染的临床株暂且置于-70℃保存，待使用时从冰箱取出进行复苏传代。

1.2 M p快速诊断试剂盒及方法 试剂盒内包括环介导恒温扩增反应管、BstDNA聚合酶；反应管中含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、 引物1：5′-ACCAA TGCCA TCAAC CCG-3′,引物2：5′-TACCG GCGTA ACGCA AAG-3′,引物3：5′-ATTTT CACCC GTGAG GGGGA GTTTT CGCTT AACCC CGTGA ACG-3′、引物4：5′-ACAGC GCTAA GGGCA TCACT GTTTT TCAAA GCCGC TTCGG TTC-3′、甜菜碱、氯化锰和钙黄绿素。检测肺炎支原体的方法包括待测样品或细菌DNA的提取、肺炎支原体的环介导恒温扩增反应和显色检测。

1.3 药敏实验 药物选择：大环内酯类抗生素代表药物红霉素(国家药品标准物质目录货号：130351-200716)。药敏实验中

药敏孔的设置：各孔98μL培养基，2μL培养至对数期的菌液，药敏浓度0.128μg/m L。M p若生长，培养5～7d培养基由红开始变黄；若不生长，培养基不变色。同时做阳性对照和阴性对照。阳性对照中不加药物，阴性对照中不加药物不加菌液。

1.4 M p耐药株DNA提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根公司）提取高纯度、高完整度的DNA产物用于后续实验。具体步骤如下：⑴取M p阳性菌液1～5m L，10000rpm离心1m in，尽量吸净上清;⑵向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮;⑶向管中加入20μL蛋白酶K，混匀;⑷加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃水浴10m in，容易应变清亮;⑸加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀;⑹将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个带有吸附柱CB3的收集管中，12000rpm离心1m in，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中;⑺向吸附柱中加入500μL缓冲液GD（使用前加无水乙醇），12000rpm离心1m in，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中;⑻向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1m in，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中;⑼重复第8步;⑽将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2m in，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液;⑾将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱液TE，室温放置2～5m in，12000rpm离心3m in，将溶液收集到离心管中。

1.5 PCR及跑胶鉴定 引物设计：L2F：5′-GTGaGtt ctccccGacc-3′，L2R：5′-ACTTTTGTACACCTCCTTGA-3′，L 22F：5′-CCCTGGTTTAA TTGCTA A-3′，L 22F：5′-TAATGTTGCTGGTGCTTT-3’。选择原因：Mp常发生耐药突变的两个DNA片段。

PCR反应体系：2×PCR M ix 12.5μL，上游引物下游引物各1μL，ddH 2O 8.5μL，DNA模板2μL，总体系为25μL。

将上述组分依次加入0.2m LEP管中，混匀点离后滴加1滴石蜡油，置于PCR仪进行扩增反应，同时设置阴性对照。PCR产物做测序鉴定有无发生基因突变。

2 结果

2.1 肺炎支原体株体外筛选及药敏试验结果

通过M p快速诊断试剂盒，笔者发现在3150株上呼吸道感染患者的咽试子中，M p感染有134株（占4.2%）。

药敏实验发现在134株M p中，红霉素浓度为0.128μg/m L时，第5d开始有生长迹象的株数为3株，第7d有5株，至第12d共有4株存活，即表示134株中有12株发生了耐药。耐药率为8.96%。药敏结果如表1。

表1 临床耐药实验阳性株编号，M IC值及生长时间

2.2 PCR产物测序结果 PCR产物送到英韦创津公司测序，经比对发现有4株发生了耐药突变，突变点均为A 2063G。发生突变的菌株为1、16、19、22，发生突变的概率为33.33%（如图1）。

图1 突变位点示意图

3 讨论

Mp对大环内酯类抗生素的耐药报道已经越来越多，来自亚洲的报道占一半以上，感染M p的患者通常为儿童和老年人及其它体质差的人群，患者免疫力弱，疾病持续时间长，临床用药时间也增加，这样以来容易引起Mp的耐药。根据笔者做的耐药筛选的实验结果，笔者追溯到病例，发现12支耐药株的病例均为儿童和老年人。也恰恰证实了，需要长期治疗的患者对大环内酯类抗生素发生耐药的可能性较高。

本研究的突变点为A 2063G，根据亚洲和欧洲的报道发现A 2063G的突变是主要的突变形式，且此突变模式有成为主导模式的趋势[1]。由于有体外实验研究发现A 2063G/A 2064G突变可以通过亚抑菌浓度传代诱导发生[2]，以笔者推测这样的趋势可能与临床大量使用抗生素有关。丹麦有报道发现，Mg（生殖支原体）也发生了同样的耐药突变[3]。长期使用抗生素诱导与临床长期使用抗生素治疗可能起着相同作用，即都能引起耐药突变的发生。临床上在发生耐药时应该如何进行持续治疗呢？在日本耐药高发的地区，临床已经开始采取交替使用不同类型的抗生素来治疗疾病，且效果较好[4]。我国有一个小型试验，5例M p感染的患者对大环内酯类抗生素发生了耐药，而用环丙沙星和糖皮质激素治疗却得以治愈[5]。香港有报道显示一例尿道感染支原体的患儿对大环内酯类严重耐药，而改为强力霉素治疗后，也得以治愈[5]。在亚洲，临床以喹诺酮类和四环素类药物作为对大环内酯类抗生素耐药的M p感染的患者的替换抗生素。因此本研究对邵阳地区肺炎支原体肺炎在治疗上抗生素使用方面的指导有着重要意义。

在此特别感谢邵阳中心医院为本实验提供的临床菌株，感谢南华大学实验室的老师和同学给予的支持。

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O b jective To get a better understanding on Macrolide-Resistant M ycoplasma pneumoniae in the Shaoyang City.Methods We collected 134 Clinical strains of patients had pneumonia that caused by M p between 2009～2011 in Shaoyang central hospital.12 Macrolide-resistant strains were detected from Susceptibility test for prelim inary screening of macrolide resistant strains.We extracted DNA from resistant strains and performed PCR and gene sequencing to detect the resistance mutant pattern.Results 4 mutant strains were found among 12 M p clinical Macrolideresistant strains.Conclusion Mp Macrolide-resistant mutant strains have been emerged in Shaoyang.A resonable treatment in Pnemonia shoud be leaded in clinic.

M ycoplasma penumonia;Macrolide-Resistant

book=25,ebook=116

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.016

国家自然科学基金（81072418/H1005）资助；湖南省教育厅青年基金（09B088）资助药物浓度耐药界定值以0.128μg/m L为准，此浓度若M p生长为耐药株，若不生长则为敏感株。

421001 湖南省衡阳市南华大学医学院病原研究所 （唐愈菲朱翠明） 422000 邵阳医学高等专科学校（唐愈菲）

朱翠明 E-mail:cuiming_zhu@yahoo.com.cn