方中明，黄玮婷，吴坤林，江 南，曾宋君*

(1．中国科学院华南植物园华南农业植物遗传育种重点实验室，广东广州510650;2．中国科学院大学，北京100049;3．东莞市农业科学研究中心，广东东莞523000)

珍珠矮(Cymbidium．nanulum Y．S．Wu ＆ S．C．Chen)为兰科兰属植物，属于中国区域性特有的地生兰，花期6月，花淡黄绿色或紫色，有香味，观赏价值高［1-2］，野生资源已十分稀少．珍珠矮在自然条件下种子萌发率低，成苗难;人工栽培时主要靠分株繁殖，繁殖速度慢．珍珠矮的无菌播种和组织培养已有初步报道，但在根状茎分化成芽的过程中，外植体易发生褐变，分化率较低［3-4］．植物组织培养中，常用的褐变抑制剂有活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、二硫苏糖醇、柠檬酸等［5-6］．作者已经报道，培养基中添加柠檬酸能明显减轻褐化，并提高根状茎的出芽数［4］．本文研究在培养基中加入不同质量浓度的柠檬酸，观察其对根状茎分化和褐变的影响，测定与褐化相关的酶的活性和总酚含量，分析这些指标和褐化及根状茎分化出芽的关系，为进一步开展珍珠矮及其它地生兰的组织培养提供参考依据．

1 材料与方法

1．1 材料

人工授粉后150 d的果实用体积分数为75%的酒精表面消毒30 s后，再以质量分数为0．1%的升汞溶液消毒15 min，无菌水冲洗4～5次．随后将消毒的荚果置于灭菌的滤纸上吸干水分，用解剖刀切开荚果，将种子散落到种子萌发培养基1/2MS+10%的椰子汁+0．5 mg/L NAA+1 g/L活性炭的培养基上，4个月左右能形成根状茎．根状茎在1/2MS+6-BA 0．5 mg/L+NAA 2．0 mg/L+10% 的椰子汁+1 g/L活性炭培养上根状茎能快速增殖．增殖所得到的根状茎用于根状茎分化和酶活性测定实验．

1．2 根状茎的分化

选取生长状态相近的根状茎，切割成长度为1．0 cm左右的切段，接种到添加不同质量浓度柠檬酸 (0、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 g/L)的分化培养基(MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1mg/L+6．0 g/L琼脂)上进行出芽诱导．每个处理10瓶，每瓶接种6个切段，重复3次．培养基的pH为5．4，培养温度为(25±2)℃，光照强度30～40 μmol/(m2·s)，光照12 h/d．根状茎在上述培养基中培养50 d能分化出芽，分化效率采用出芽数表示(出芽数=总出芽个数/接种的根状茎数)．试验数据分析采用SPSS 11．0软件进行方差分析(ANOVA)，以Duncan’s新复极差在0．05水平上进行显著性差异分析．

1．3 酶活性的测定方法

1．3．1 多酚氧化酶(PPO)活性测定 按朱广廉［7］的方法进行，以每秒钟A525的变化0．01为一个酶活性单位．

1．3．2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定 参照李合生［8］的方法，以A290变化0．01为一个酶活性单位．

1．3．3 过氧化物酶(POD)活性测定 用愈创木酚法［8］，以每分钟 OD470变化0．01为一个活性单位．

1．3．4 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 用氮蓝四唑(NBT)光还原法［8］测定，以抑制NBT光化还原50%的酶液量为一个酶活性单位．

1．3．5 过氧化氢酶(CAT)活性 用紫外分光光度法［9］，以每分钟吸光度值的降低表示活性．

1．3．6 总酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu(福林酚)法［10］．

2 结果与分析

2．1 柠檬酸对珍珠矮根状茎分化和褐变的影响

和未加入柠檬酸(对照)相比(表1)，在分化培养基中添加不同质量浓度的柠檬酸，根状茎的平均出芽数显著增加，随着柠檬酸质量浓度的升高，平均出芽数逐步升高，褐变程度变轻，当在培养基中添加1．0 g/L 柠檬酸时，平均出芽数最高，达到4．48，且生长良好，未见明显褐化．当柠檬酸高于1．0 g/L时，随着质量浓度的继续增加，褐色程度变重，根状茎平均出芽数下降，且生长状况变差．

表1 柠檬酸对珍珠矮根状茎的分化和褐变的影响Table 1 Effects of CA concentration in medium on differentiation and browning inhibition of rhizomes of Cymbidium nanulum

2．2 培养基中柠檬酸质量浓度对珍珠矮根状茎中PPO、PAL、POD酶活性的影响

根状茎在添加不同质量浓度柠檬酸的分化培养基(MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1 mg/L)上进行培养时，POD、PPO、PAL三者活性变化趋势一致(图1)．添加的柠檬酸在 0．1～1．0 g/L时，随着添加的柠檬酸质量浓度的升高，珍珠矮根状茎中PPO、PAL、POD酶活性开始下降，而当添加的柠檬酸高于1．0 g/L时，随着质量浓度的继续增加，这3种酶的活性升高．根状茎中3种酶的活性均以1．0 g/L柠檬酸处理的最低，除PPO酶活性与添加2．0 g/L柠檬酸，与其它质量浓度相比，均表现出显著性差异．

图1 培养基中柠檬酸质量浓度对PPO、PAL、POD酶活性的影响Figure 1 Effects of CA concentration in medium on the activities of PPO，PAL and POD

2．3 培养基中柠檬酸对珍珠矮根状茎中SOD、CAT酶活性的影响

图2 培养基中柠檬酸质量浓度对SOD酶活性的影响Figure 2 Effects of CA concentration in medium on the activities of SOD

图3 培养基中柠檬酸质量浓度对CAT酶活性的影响Figure 3 Effects of CA concentration in medium on the activities of CAT

根状茎在添加不同质量浓度柠檬酸的分化培养基中培养时，SOD酶活性和CAT酶活性变化趋势基本一致(图2、图3):柠檬酸在0．1～1．0 g/L范围时，随着柠檬酸质量浓度的升高，这2种酶的活性均上升，而当柠檬酸高于1．0 g/后时，这2种酶的活性逐渐下降．在所有处理中，SOD酶活性在柠檬酸含量为0．5、1．0、2．0 g/L 时，未表现出显著性差异，在添加0．1或5．0 g/L柠檬酸，与未添加柠檬酸的对照相比也未表现出显著性差异．而在培养基中加入不同质量浓度的柠檬酸时，CAT酶活性均高于对照，添加1．0 g/L柠檬酸时高于所有其它处理并表现出显著性差异．

2．4 培养基中柠檬酸含量对珍珠矮根状茎中总酚的影响

根状茎在添加不同质量浓度柠檬酸的分化培养基 MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1 mg/L中培养时，柠檬酸在0．1～1．0 g/L时，根状茎总酚含量减低，柠檬酸为1．0 g/L时，总酚含量最低，显著低于其它所有的处理．超过此质量浓度，随着柠檬酸含量升高，总酚含量逐步升高，当柠檬酸为5．0 g/L时，总酚含量显著高于对照(图4)．

图4 培养基中柠檬酸质量浓度对总酚含量的影响Figure 4 Effects of concentration of CA in medium on the total phenol content

3 讨论

褐变是影响植物组织培养成功的重要因素．引起培养材料褐化的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等［11］．酚类物质是外植体中酶促褐变反应中的底物，总酚含量与褐化关系密切，是组织培养褐变的重要因素之一［12］;而PPO、POD和PAL氧化酚类物质产生的代谢物扩散到培养基中，就会抑制其它酶的活性，毒害外植体组织．因此PPO、POD、PAL活性以及总酚含量的变化与褐化程度密切相关［13］，可作为褐变程度的参考．国兰等在离体培养时都有褐变现象出现．蝴蝶兰外植体褐变过程与PAL基因表达相关［14］，PAL的合成及活性的增加，是褐变发生的前提［15］．

本试验中，在培养基中添加0．1～1．0 g/L褐化抑制剂柠檬酸时，根状茎平均出芽数增加，PPO、POD及PAL活性降低，同时总酚含量降低，当柠檬酸含量为1．0 g/L时，平均出芽数最高，酶活性及总酚含量达到最低，培养基褐化得到了有效的抑制，并且有利于根状茎分化．而柠檬酸含量超过1．0 g/L时，PPO、POD、PAL活性反而升高，可能因为柠檬酸含量过高，使植物细胞渗透势过大，对酶活性及褐化抑制效果都变差，本试验中根状茎的出芽数也显示出下降的趋势．柠檬酸是呼吸链中的一个抑制剂，在果实的褐变中作为抗褐变剂被使用．另外，由于柠檬酸鳌合酚类合成及氧化酶活性位点的Cu2+［16］，抑制了PPO等酶的活性，也影响材料褐变的程度．这与蝴蝶兰［17］等中不同浓度柠檬酸处理在一定程度上抑制了褐化及相关酶活性的报道一致．外植体组织发生褐变时，膜脂过氧化加剧，导致膜透性增加，有关褐变发生的关键原因与细胞膜完整性被破坏．蝴蝶兰外植体在褐变过程中，SOD和CAT活力均下降［17］．本试验中，在添加不同质量浓度的柠檬酸后，SOD、CAT酶活性增高，说明组织细胞的膜脂过氧化减弱，褐化得到了较好控制．柠檬酸在1．0 g/L时对珍珠矮根状茎分化出芽及控制褐化效果最好．

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