赵见文田军彪张颜伟李佃贵杨丽静

（1河北医科大学，河北省石家庄市中山东路361号，050017；2河北省中医院）

实验研究

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影响

赵见文1田军彪2张颜伟1李佃贵2杨丽静2

（1河北医科大学，河北省石家庄市中山东路361号，050017；2河北省中医院）

目的：观察化浊解毒活血通络方对小鼠脑缺血再灌注损伤的局部炎症反应的影响。方法：将50只昆明小鼠随机均分为模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、尼莫地平组、假手术组。采用双侧颈总动脉结扎法合并尾端放血制造脑缺血再灌注模型。手术造模成功分别给予高、低剂量组化浊解毒活血通络方中药灌服。在治疗后用放免法检测各组小鼠血清中IL-6、TNF -α的表达水平。结果：化浊解毒活血通络方高剂量组小鼠中IL-6和TNF-α的表达水平明显低于模型组，与假手术组及尼莫地平组比较无统计学意义。结论：化浊解毒活血通络方可以抑制小鼠脑缺血再灌注损伤时炎症细胞因子的表达，减少白细胞的浸润，降低脑缺血再灌注损伤的程度。

化浊解毒活血通络方；脑缺血再灌注；炎症反应；白介素-6；肿瘤坏死因子-α

脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury）是一个以缺血缺氧为始动因素，脑组织细胞在再灌注作用下所产生的包括炎症反应、氧自由基生产增多、钙超载、兴奋性氨基酸毒性、凋亡基因激活等诸多环节共同存在从而导致神经元凋亡的级联反应。脑缺血诱导的炎症细胞因子如白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）等的表达在脑缺血再灌注炎症损伤中起着重要作用。化浊解毒活血通络法是以浊毒理论［1-2］为指导，根据浊毒致病理论与脑系疾患的相关性研究而确立的中医治疗体系，广泛应用于缺血性脑血管病治疗之中。本研究采用线拴法造成小鼠脑缺血再灌注模型，观察化浊解毒活血通络方对模型小鼠炎症细胞因子IL-6和TNF-α表达的影响及其对神经元产生保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器及药物 试验动物：健康昆明雄性小鼠50只（河北医科大学实验动物中心提供，体重20～23g，SPF级）。试验仪器：离心机、循环水真空泵、γ-放射免疫计数器、电子天平等。化浊解毒活血通络方组成：菖蒲、茯苓、泽泻、黄连、川芎、丹参、赤芍、当归、地龙、郁金等。对照组药物：尼莫地平；试剂：TNF-α和IL-6放免检测试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所提供）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组及模型的构建 健康昆明小鼠50只随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、中药高剂量组、中药低剂量组5组，每组10只。在25℃的无菌环境内行手术造模。用10%水合氯醛以350mg/kg腹腔注射麻醉后，取仰卧位将小鼠四肢与牙齿分别固定于操作台上，背部置一松软棉垫，腹部覆盖适量棉絮。在小鼠前颈部剪毛备皮，碘伏酒精常规消毒。颈正中切口，分离双侧颈总动脉，套4号丝线扣备用，拉紧丝扣，阻断血流。手术过程中动作轻柔规范，严格执行无菌操作。术后可见小鼠惊厥、呼吸深慢、心跳加快、口唇发紫，同时在距尾尖1cm处剪断放血。在放血过程中需谨慎观察小鼠生命体征，放血约0.3mL迅速热凝止血。阻断血流10min松开丝扣，灌注10min后，再次阻断血流10min，第二次再灌注后观察10min，如小鼠呼吸、心跳平稳，即可缝合皮肤，伤口处轻洒少量青霉素粉末以预防感染。其中假手术组仅分离颈总动脉，套丝扣不阻断血流，尾部不放血，观察时间与其他各组相同。随后参考Longa等评分法［3］对小鼠的行为缺陷进行评价，1～4分者纳入后期试验，无神经功能缺失症状及死亡者立即剔除并及时补充。

1.2.2 试验动物的给药方法 脑缺血再灌注损伤模型小鼠于术后第二天开始给药。假手术组、模型组给予生理盐水10mL/（kg·d）灌服。中药高剂量组以上述中药2.9g/（kg·d）灌服，中药低剂量组以上述中药1.45g/（kg·d）灌服。尼莫地平组灌服尼莫地平液0.03g/（kg·d），均每日1次，连续治疗7d。

1.2.3 放免法检测血清IL-6和TNF-α水平 各组小鼠于治疗结束后以摘除小鼠眼球的方式取得血清，离心后取上清液，采用放免法检测血清中IL-6和TNF-α水平。

1.3 统计学方法 所有数据均以均数±标准差表示，SPSS11.0软件包进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量

2 结果

各组小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量见表1。结果显示：与假手术组比较，模型组与化浊解毒方低剂量组小鼠血清中IL-6、TNF-α含量显著升高（P＜0.01），化浊解毒方高剂量组、尼莫地平组无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，化浊解毒方低剂量组小鼠血清中IL-6与TNF-α水平均无统计学意义（P＞0.05），化浊解毒方高剂量组小鼠血清中IL-6、TNF -α含量显著降低（P＜0.01）。与尼莫地平组比较，化浊解毒方低剂量组小鼠血清中IL-6、TNF-α显著升高（P＜0.01），化浊解毒方高剂量组无统计学意义（P＞0.05）。与化浊解毒方低剂量组比较，化浊解毒方高剂量组小鼠血清中IL-6、TNF-α含量显著降低（P＜0.01）。

3 讨论

IL-6是一种重要的前炎症细胞因子，它是一种由多个氨基酸组成的糖蛋白，具有较高的生物活性。在生理条件下，IL-6在脑内的表达仅处于低水平状态。脑缺血再灌注损伤后，随着中性粒细胞以及巨噬细胞的浸润IL-6表达明显增加。TNF-α在脑组织中主要是由小胶质细胞和星形细胞分泌产生。它具有复杂广泛的生物学效应，能介导IL-6等多种炎症介质的产生和免疫调节，并参与影响脂质以及糖类等物质的代谢过程。脑组织缺血缺氧以及血液再灌注时，TNF -α能够刺激损伤血管内皮细胞使得白细胞对血管内皮的黏附性增强，内皮细胞的凝血活性状态被改变，PAF、TXA2、ET等缩血管物质被释放，进而发生血管收缩并最终导致血管的急性闭塞。TNF-α还能使兴奋性氨基酸释放增加，产生神经毒性。炎症反应在中枢神经系统缺血损伤中起着关键作用［4］。当脑缺血再灌注损伤时，包括IL-6和TNF-α等在内的多种炎性细胞因子表达增多，在细胞表面浸润。IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的释放增加继发诸多级联反应导致血脑屏障被打破，局部脑组织发生肿胀变性及神经元的损伤。

本研究显示，化浊解毒活血通络方高剂量组IL-6和TNF-α的表达水平明显低于局灶性脑缺血再灌注模型组，与假手术组及尼莫地平组比较无显著性差异。化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤小鼠有明显的保护作用，其作用机制可能与抑制脑缺血再灌注后炎性细胞因子TNF-α、IL-6的产生、拮抗TNF-α、IL-6引发的一系列损伤，以减轻其神经毒性。但化浊解毒活血通络方对于脑缺血再灌注损伤级联反应中的氧自由基生成、钙超载、兴奋性氨基酸毒性、凋亡基因激活等其他环节有无调节作用目前还不明确，尚待研究的进一步深入。

［1］李佃贵，李海滨，裴林，等.慢性萎缩性胃炎从浊毒论治.四川中医，2004，22（1）：17.

［2］吴深涛，糖尿病病机的启变要素—浊毒.上海中医药大学学报，2004，18（1）：24.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson s，et al.Reversible midge Cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.stroke，1989，20（1）：84.

［4］Elkind MS，Coates K，Tai W.etal.Levels of acute phase proteins.remain stable after isehemie stroke.BMC Neur0l，2006，（16）6：37.

（2010-12-10收稿）

Impact of Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula on IL-6 and TNF-α in Rats with Ischemia-reperfusion Injury

Zhao Jianwen1，Tian Junbiao2，Zhang Yanwei1，et al.
（1 Hebei Medical University，Add.：No.361，Zhongshan East Road，Shijiazhuang，Hebei Province，postal code：050017；2 Heibei Hospital of Chinese Medicine）

Objective：To investigate impact of Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula on local inflammatory reaction in rats with ischemia-reperfusion injury.Methods：Forty Kunming mice were randomized to model group，high dose group，low dose group，Nimodipine group and sham operation group.Through ligature on bilateral carotid artery the disease model was established.The medication groups respectively

high dose or low dose of the Chinese medicine.After treatment，IL-6 and TNF-α levels were determined.Results：The high dose group showed significantly lower level of IL-6 and TNF-α than the model group did，but the difference was not significant in comparison to sham operation group and Nimodipine group.Conclusion：Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula can inhibit expression of inflammatory reaction factors，reduce inflammatory reaction so as to lower the intensity of ischemia-reperfusion injury.

Huazhuo Jiedu Huoxue Tongluo Formula，ischemia-reperfusion injury，Inflammatory reaction，IL-6，TNF-α

国家中医药管理局浊毒证重点研究室专项课题（编号ZD200821-10）；河北省中医药管理局科研计划课题（编号2010020）