宋增梅，黄慧聪，潘长旺

蛋白质组学是一门迅速发展的学科，在疾病或组织的蛋白表达和功能研究中，双向凝胶电泳（2－DE）是强有力的研究工具［1］。双向凝胶电泳由于其在展示全部蛋白质表达改变并鉴定特异性蛋白方面的优势，已成为目前蛋白质组学研究首选的分离技术［2］。

广州管圆线虫病，又称嗜酸粒细胞增多性脑膜炎或嗜酸粒细胞增多性脑膜脑炎，是由广州管圆线虫（Angiostrongyluscantonensis）寄生于人体中枢神经系统所致，是一种人兽共患病。但是，目前国内外关于广州管圆线虫蛋白组学的报导不多，亦无关于此线虫系统的双向电泳的报道。为了建立具有高分辨率可重复的广州管圆线虫双向凝胶电泳技术，我们针对双向电泳技术中的各种参数进行初步探索和优化，为广州管圆线虫蛋白质组学的进一步研究和新功能蛋白的发现提供基础的科学材料和参考方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源 广州管圆线虫Ⅴ期幼虫由本实验室分离、－80℃保存。

1.2 主要试剂及仪器 尿素（urea）、硫脲（thiourea）、3－［3－（胆酰胺基丙基）二甲氨基］丙磺酸盐（CHAPS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、固相胶条（IPG strip pH 3～10/pH 4～7，17cm），Bio－lyte pH 3～10，2－D clean up试剂盒等均购于Bio－Rad公司；蛋白酶抑制剂混合液（Sigma），其它化学试剂均为分析纯。

PROTEAN IEF CELL聚焦仪，PROTEAN II XL垂直板电泳仪，GS－800扫描成像系统，PDQuest凝胶图像分析软件（Bio－Rad公司），722s紫外可见分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备 50条广州管圆线虫Ⅴ期幼虫用0.01 mol/L PBS洗涤3次，收集于1.5mL Ep管内；加入200μL裂解 液（7mol/L 尿 素、2mol/L 硫 脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris－Base、40mmol/L DTT、0.2%Bio－Lyte）和 1 μL蛋白酶抑制剂混合液；用研磨棒在冰上研磨使其充分溶解，于冻存管中室温静置1h；液氮中冻融3次；4℃，12 000 r/min离心30min，收集上清；2－D clean up试剂盒处理所得上清；100μL裂解液重悬沉淀，Bradford法测定蛋白质浓度，－20℃冰箱保存备用。

1.3.2 等电聚焦电泳（Isoelectronic Focusing） 参考文献［3］方法，根据样品情况适当改进。分别将200μg蛋白样品与与水化上样缓冲液（8mol/L 尿素、2%CHAPS、15mmol/L DTT、0.2%Bio－Lyte、0.001%溴酚蓝）共300μL混合后均匀加入聚焦槽内；选用pH 3～10和pH 4～7（17cm，线性）的IPG胶条，胶条胶面朝下，水化液浸湿整个胶条，上面覆盖3mL矿物油，进行第一向等电聚焦电泳，调整运行参数如表1所示。

表1 等电聚焦参数Tab.1 The parameters of isoelectric focusing

1.3.3 第二向SDS电泳（SDS－PAGE） 聚焦后的IPG 胶条依次在平衡缓冲液 Ⅰ（6mol/L尿素、2%SDS、20% 甘油、50mmol/L Tris－HCl pH 8.8、1%DTT）和平衡缓冲液Ⅱ（前4种同上，2.5%IAA）中各平衡15min；平衡后移至12%SDS－PAGE凝胶上端，2mL热的琼脂糖溶液封顶。电泳参数设置为10mA/gel电泳15min后改为30mA/gel，进行电泳。

1.3.4 银染 电泳结束后2块凝胶按照表2的程序进行硝酸银染色。

表2 凝胶银染程序Tab.2 The procedures of silver staining

1.3.5 图像的采集与处理 银染的凝胶用GS－800Calibrated Densitometer图像扫描仪透射扫描，PDQuest7.4.0软件对2－DE凝胶采集图像进行详细处理、分析。

2 结 果

2.1 样品的蛋白质含量 按照Bradford法，配制不同浓度BSA作标准曲线，加入考马斯亮蓝G250工作液，波长595nm测得标准曲线相关系数为0.974 7，见图1所示。经计算广州管圆线虫Ⅴ期幼虫蛋白含量约为10.4mg/mL。

图1 蛋白质浓度标准曲线Fig.1 The standard curve of protein concentration

2.2 两种胶条进行2－DE的图像比较 以pH3～10胶条进行的2－DE，蛋白质点分布较集中，各蛋白点间间距较小，分辨率较低（图2A）；以pH4～7胶条进行的2－DE，胶虽然分离蛋白范围相对较小，但分辨率较高，蛋白点为719个，各蛋白点间距相对较大，且蛋白分布均匀，分子量大多分布在24.3～97.2kDa之间（图2B）。

因此，在进一步进行广州管圆线虫蛋白质组学研究过程中，选用固相胶条（IPG，pH4～7，17cm）进行电泳。在相隔60d后运用广州管圆线虫Ⅴ期雄虫的蛋白质进行双向电泳后，得到如图3所示的电泳图谱。如图所示，蛋白点较多且清楚，没有明显条纹，背景干净清晰，蛋白分布均匀，效果比较好。

图2 A：固相胶条pH3～10；B：固相胶条pH4～7Fig.2 A：IPG strip of pH3～10；B：IPG strip of pH4～7

图3 广州管圆线虫Ⅴ期雄虫双向电泳银染图Fig.3 The silver stained map of two－dimensional electrophoresis on larvaeⅤof nake A.cantonensis

3 讨 论

近年来，蛋白组学广泛应用在血液［4］、尿液［5］、唾液［6］等组织或疾病的诊断与预后，受到人们的关注。蛋白质组具有的高通量、大规模、整体性蛋白质水平的研究特点成为了解、探索及研究寄生虫学最有利的工具之一。运用蛋白质组学可以研究提供寄生虫生活史不同阶段的发育蛋白图谱、细胞图谱和蛋白质功能，为寄生虫药物治疗和疫苗研究提供新靶点和候选物质。双向凝胶电泳（two－dimensional gel electrophoresis，2－DE）是目前常用的一种能够连续在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，广泛的应用于生物学研究的各个方面［7］。而且各种蛋白质数据库的建立，蛋白质组学研究获得了广泛和快速的发展，不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为许多系统疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径［8－10］。

广州管圆线虫能够侵入人体神经系统致病，对人类造成极大危害。在此次实验中，我们采用与人类关系最密切的广州管圆线虫Ⅴ期幼虫作为研究对象，首先，在样品的制备过程中尽可能解聚蛋白和扩大其溶解度，提高分辨率，常用方法是化学法和机械裂解法相结合。我们采取加入裂解液进行研磨、反复冻融的方法制备可溶性蛋白，同时注意温度控制和避免使用对蛋白有影响的化学制剂；其次，在电泳的各个环节中，其影响因素较多，比如蛋白样品的上样量、还原剂的浓度、聚焦电压的控制、染色方法等［11］。其中，胶条pH 的选择非常重要，目前有许多pH范围的胶条，首先选择宽范围的胶条如pH3～10，其分离的蛋白范围较大，但宽范围的胶条是否适合实验样本，需根据具体情况采用不同范围胶条电泳后进行比较分析。窄范围的胶条如pH4～7虽然分离蛋白的范围相对较小，但各蛋白点间距较大，切胶容易，在相同的pH范围内可检测到更多的蛋白点。因此，我们采用不同pH的胶条（分别为pH3～10和pH4～7）对制备的广州管圆线虫Ⅴ期幼虫的蛋白质进行双向电泳分析。结果发现，采用pH3～10的胶条进行双向电泳，蛋白质点分布较集中但各蛋白点间间距较小；而pH4～7的胶条进行的双向电泳分辨率较高，蛋白点为719个，且蛋白分布均一，其分离的各蛋白点间距相对较大，避免了高丰度掩盖了低丰度蛋白点，在相同的pH范围内，检测到的蛋白点更多，灵敏度更高。因此，选择pH4～7的IPG胶条分离广州管圆线虫Ⅴ期幼虫蛋白较为理想。高浓度还原剂DTT也能影响2－DE的结果，会造成等点聚焦不充分，蛋白质不能有效分离［11］。此次实验选取水化液DTT浓度为15mmol/L，得到的分离效果相对较好，各蛋白点清晰可见。此外，若蛋白上样量过大，各蛋白点显得大、浓，相邻点蛋白浓度过高而重叠，而且可能会出现水平条纹或拖尾现象。本实验中用200μg蛋白上样量分离的蛋白点比较清晰。在染色方法中，银染可检出凝胶上0.1～0.5ng的蛋白质，比普通考马斯亮蓝染色法灵敏度高50～100倍［11］。我们运用银染方法，检测出719个蛋白点。第三，我们也考虑到二维电泳的重复性问题，在控制上样量、选择合适pH值的IPG胶条、固定各项参数后，重复实验显示，该实验方法具有较高的重复性和稳定性。

本实验筛选出pH4～7范围内广州管圆线虫的蛋白质点分离较好，初步建立了广州管圆线虫Ⅴ期幼虫蛋白质组的双向电泳凝胶图谱，为进一步进行广州管圆线虫蛋白质组学分析研究提供了实验参考。利用蛋白质组学寻找差异表达的蛋白可能为由广州管圆线虫引起的疾病的药物研究提供靶标和候选疫苗分子。但是，其详细机制需要进一步的研究。

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