张志珊，严延生，翁育伟

登革热是由登革病毒引起的急性虫媒传染病，广泛流行热带、亚热带地区，100多个国家有地方性登革热传播，每年均出现几百万病例，其中以东南亚国家最为严重。我国东南沿海一带长期有输入性病例，且由此引起的本地暴发流行越来越频繁，加强登革病毒的实验室检测，对于控制传染源，减少疾病的传播起着至关重要的作用。

目前登革热的实验室诊断主要包括病毒分离、基因诊断技术和血清学检测。由于登革热的病毒血症期很短，因此病毒分离和基因诊断受到标本采集时间的限制，同时对设备、实验室条件及人员素质要求很高，不利于推广。ELISA法、免疫层析法具有较高的敏感性和特异性，且操作简便快速，是检测登革热感染的主要方法。目前国内大多数实验室主要采用澳大利亚Panbio公司生产的检测试剂盒，但其价格昂贵，一般实验室难以承受，且运送时间长，难以应对突发事件。而国内商业化的试剂盒其灵敏度和特异性大多不够理想。本文采用原核系统表达登革2型病毒外膜蛋白基因，重组蛋白应用于血清学检测，为进一步开发登革热血清学检测试剂盒打下基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 病毒株、细胞及血清来源 登革热病毒2型（NGC株）、C6／36细胞、登革病毒2型感染者血清、日本脑炎IgG阳性血清由福建省疾病预防控制中心提供。

1．1．2 质粒和主要试剂 表达载体pET30a、大肠杆菌BL21（DE3）福建省疾病预防控制中心保存，大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司。RPMI1640细胞培养液购自Gibco BRL公司，病毒RNA提取试剂盒、一步法RT－PCR试剂盒购自QIAGEN公司。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶购自TaKaRa公司。用于血清检测的酶标板条、酶标二抗由万泰公司提供。参比试剂为澳大利亚Panbio生产的IgG捕获法ELISA检测试剂盒。

1．2 方法

1．2．1 病毒的增殖及核酸的提取 C6／36细胞在PRMI1640培养液（含10%胎牛血清，pH7．0）中于33℃、5%CO2条件下培养至单层后，接种病毒，静置吸附1h后，加入维持培养液（含2%胎牛血清，pH7．0），培养3d后收集上清，按操作说明书进行核酸提取。

1．2．2 目的片段的扩增 参考GenBank公布的登革热病毒2型序列（AF038403）设计1对引物用于扩增登革2型E蛋白去除C端疏水区的基因片段。正向 引 物：5′－GTGAATTCATGCGTTGTATTGGAATATCA－3′（划线部分为引入的EcoRⅠ酶切位点），反向引物：5′－GATCTCGAGGAACATTTG－GCCGATTGAG－3′（划线部分为引入的XhoⅠ酶切位点）。PCR反应体系：5×buffer 10μL，dNTP 2 μL，正、反向引物各2μL，Onestep RT－PCR Enzyme 2μL，RNA 5μL，加水至50μL。按下列程序进行扩增：50℃30min，95℃15min，然后94℃40s，55℃40s，72℃2min，进行30循环，最后72℃延伸10min。

1．2．3 表达载体的构建 扩增产物用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与表达载体pET30a连接，转化DH5α，涂布含有30μg／mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养后，挑取单个菌落，接种LB（含30μg／mL卡那霉素）过夜培养后，提取质粒，用BamHI／XhoI双酶切鉴定。酶切鉴定正确的重组克隆重组克隆命名为pET30a－DEN2，用双脱氧终止法进行DNA序列测定，应用DNASTAR中的EditSeq和SeqMan软件对插入片段的序列进行分析。

1．2．4 重组蛋白的初步表达 鉴定正确的重组载体及pET30a空载体（作为对照）同时转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG（终浓度为1mmol／L）诱导表达4h后收集菌体，菌体蛋白用SDS－PAGE胶进行电泳。操作方法按《分子克隆实验指南》［1］进行。

1．2．5 重组蛋白的大量表达及电洗脱纯化 按《分子克隆实验指南》进行［1］。

1．2．6 间接免疫荧光检测（IFTA） 用登革病毒2型感染后的C6／36细胞制成抗原片，登革热病人血清及作为对照的正常人血清用0．01mmol／L PBS进行倍比稀释。具体操作步骤参见文献［2］。抗体效价以可以看见免疫荧光的血清最高稀释度表示。

1．2．7 间接ELISA法检测IgG 用纯化的重组抗原包被板条（100ng／孔），37℃作用2h后，PBST洗涤1次，每孔加入封闭液（5%BSA／PBS）200μL，37℃作用2h，弃去孔中液体，加入待检血清（用样本稀释液1∶20稀释）100μL，37℃作用30min，PBST洗涤5次，加入酶标二抗100μL，37℃作用30min后PBST洗涤5次，加入显色液显色10min，最后加入2mol／L H2SO4终止反应。450nm波长下检测OD值。以正常对照组血清平均OD值加上2S作为cutoff值［3］。以IFTA为标准，评价重组蛋白检测登革2型IgG抗体的敏感度和特异性，公式为：敏感性＝真阳性／（真阳性＋假阴性）×100%；特异性＝真阴性／（真阴性＋假阳性）×100%。用重组抗原和澳大利亚Panbio IgG捕获法ELISA试剂盒同时对标本进行检测，结果用χ2检验分析。

2 结 果

2．1 重组质粒的酶切鉴定结果 重组质粒经EcoRⅠ／XhoI双酶切后电泳，插入片段的大小与预期的一致（1 206bp），结果见图1。同时测序结果表明，插入片段的序列与原病毒株的序列相符，且读码框正确，表明重组载体构建成功。

2．2 重组质粒的初步表达 重组蛋白由于融合了表达载体上58个氨基酸，预期分子量为50．8kD。重组质粒pET30a－DEN2经IPTG诱导后，用12%SDS－PAGE电泳，与对照菌（pET30a转化BL21）相比，在45～66kD之间有一条明显的蛋白带，与预期分子量相符，见图2。

图1 重组质粒的酶切鉴定1：100bp Ladder DNA marker；2～4：pET30a－DEN2经EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切；5：pET30a经EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切Fig．1 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion1：100bp Ladder DNA marker；2－4：pET30a－DEN2digested by EcoRⅠ／XhoⅠ；5：pET30adigested by EcoRⅠ／XhoⅠ

图2 重组质粒pET30a－DEN2表达产物的SDS－PAGE分析1：分子量标准（从上至下：66．0、45．0、36．0、29．0、24．0、20．1、14．2kDa）；2：pET30a－DEN2表达产物；3：pET30a表达产物Fig．2 SDS－PAGE analysis of expression on recombinant plasmid pET30a－DEN21：Molecule weight marker（from top to bottom：66．0，45．0，36．0，29．0，24．0，20．1，14．2kDa，respectively）；2：pET30a－DEN2product；3：pET30acontrol

2．3 重组蛋白应用于检测登革2型IgG抗体 以纯化重组抗原100ng／孔包被板条，用间接ELISA法检测46份登革2型感染者血清、31份正常人血清和8份日本脑炎IgG阳性的人血清。46份患者血清中检出44份阳性，31份正常人血清中检出1例阳性，8份日本脑炎IgG阳性血清结果全为阴性。以IFTA为参照标准，重组抗原检测登革2型IgG抗体的敏感性为95．6%，特异性为96．8%。用重组抗原和澳大利亚Panbio IgG捕获法ELISA试剂盒同时对77份登革2型可疑感染者血清进行检测，结果见表1。χ2检验显示两种方法对登革2型IgG的检出率差别无统计学意义（P＞0．05）。

表1 重组抗原与Panbio试剂盒对77份登革2型可疑感染者血清IgG检测结果的比较Tab．1 Comparison of detecting DEN2IgG in 77sera by indirect ELISA with recombinant protein and Panbio Dengue IgG capture ELISA

3 讨 论

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，是登革热的病原体。其基因组编码3个结构蛋白（C、prM／M、E）和7个非结构蛋白（NS1－5）。其中E蛋白在病毒吸附宿主细胞，pH介导或抗体特异性膜融合促进病毒进入细胞、病毒组装以及诱导保护性免疫和病毒中和抗体中起着重要的作用［4－6］。因此E蛋白成为组装检测试剂盒和亚单位候选疫苗的常用抗原。国内外学者分别运用不同的载体、不同的表达系统对全长E基因进行了表达。Kelly［7］等人应用杆状病毒表达登革2型全长E蛋白，并证实其免疫原性。魏惠永［8］在毕赤酵母细胞中成功表达登革2型全长E蛋白，并保留其免疫反应性。但是全长的E蛋白大多数表达产量较低，不利于重组蛋白的纯化及研究应用。

通过对E基因序列的分析表明，E蛋白C端100个氨基酸为疏水区，因此选择基因片段进行重组蛋白表达应避开此区域。研究表明，去除C端疏水区可以提高E蛋白的表达量。Sugrue［9］分别用大肠杆菌和毕赤酵母细胞表达登革1型全长E蛋白，发现毕赤酵母表达的全长E蛋白易降解，但是去除C端疏水区后产量提高至100μg／L而且不会降解。Chiu［10］等用大肠杆菌表达登革2型去除C端疏水区的E蛋白，重组蛋白可以抑制2型病毒感染BHK细胞时空斑的形成。本文采用大肠杆菌表达登革2型N端80%的E蛋白，纯化后应用于登革2型IgG抗体的检测，其灵敏度为95．6%，特异性达到96．8%，与同是黄病毒科黄病毒属的日本脑炎病毒之间无交叉反应。与Panbio试剂相比，本研究获得的重组蛋白具有相似的敏感性和特异性。Panbio公司生产的登革检测试剂盒是目前世界上公认敏感性和特异性较好的试剂盒，其采用的重组抗原为昆虫细胞表达的N端80%的E蛋白［11］。由于本研究研制的重组抗原采用原核表达系统，大大降低了成本，具有潜在的应用前景，同时也为研究其它型别的抗原提供了依据。但是对于研制的2型重组抗原是否具有型别特异性，与其它型别的登革病毒抗体是否有交叉反应，有待于收集其它型别的血清进一步进行研究。

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