侯素云，王宗权，贾继明

（石家庄以岭药业股份有限公司技术部，河北石家庄050035）

黄芪甲苷提取物中黄芪甲苷含量测定方法比较研究

侯素云，王宗权，贾继明

（石家庄以岭药业股份有限公司技术部，河北石家庄050035）

目的比较高效液相色谱-蒸发光散射检测（high Pressure liquid chromatograPhy-evaPortive light scattering detector，HPLC-ELSD）内标法和柱前衍生法测定黄芪甲苷提取物中黄芪甲苷含量的差异。方法分别采用HPLC-ELSD内标法和柱前衍生法测定黄芪甲苷提取物中黄芪甲苷的含量，比较2种方法对测定结果的精密度、重复性、稳定性和准确度及不同批次产品测定结果的差异。结果2种方法的测定结果差异无统计学意义，但是采用柱前衍生法测定结果的精密度、重复性、稳定性和准确度均好于HPLC-ELSD内标法。结论采用柱前衍生法测定能更好地控制产品的质量。

黄芪；中草药；色谱法，高压液相

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞痛痹、托毒排脓、敛疮生肌的功效［1］。黄芪甲苷亦称为黄芪皂苷Ⅳ，是从黄芪中分离得到的一种活性的皂苷类化合物，主要具有改善心肌缺血、心肌梗死、正性肌力、抗衰老、免疫调节等作用［2］。黄芪药材及其相关的制剂都将黄芪甲苷作为含量测定的指标，目前关于黄芪甲苷的含量测定主要是采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（high Pressure liquid chromatograPhy-evaPortive light scattering detector，HPLC-ELSD）外标法［3-4］，很少采用HPLC-ELSD内标法［5］和柱前衍生［6-7］等方法。由于蒸发光散射检测器的重现性较差，因此测定黄芪甲苷的含量不够准确。本实验对HPLC-ELSD内标法及柱前衍生法进行了比较。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996 PDA检测器，2420蒸发光散射检测器（Waters公司），EmPower 2色谱工作站（Waters公司），Milli-Q超纯水机（美国MilliPore公司），甲醇、乙腈和四氢呋喃均为色谱纯，其余的为分析纯。

黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所（批号110781-200613），人参皂苷Rb2购自中国药品生物制品检定所（批号111715-200802，含量以94.8%计），不同批号的黄芪甲苷提取物由河北以岭医药研究院自制（利用NMR等波谱技术鉴定了化学结构，经高效液相色谱法（high Pressure liquid chromatograPhy，HPLC）面积归一化法检测，纯度均＞94%）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

2.1.1.1 HPLC-ELSD内标法对照品溶液的制备：对照品溶液的配制，精密称取在五氧化二磷中减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解配制成0.562g/L黄芪甲苷对照品溶液。内标溶液的配制，精密称取人参皂苷Rb2对照品适量，加甲醇溶解配制成0.478mg/mL人参皂苷Rb2对照品溶液。

2.1.1.2 柱前衍生法对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷中减压干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，加吡啶溶解配制成0.561g/L的黄芪甲苷对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

2.1.2.1 HPLC-ELSD内标法供试品溶液的制备：取黄芪甲苷提取物约12mg，精密称定，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取1mL，置10mL量瓶中，加入1mL内标溶液，用甲醇定容后，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。

2.1.2.2 柱前衍生法供试品溶液的制备：取黄芪甲苷提取物12mg，精密称定，置50mL量瓶中，用吡啶溶解并稀释至刻度。精密吸取样品溶液0.5mL，加入氯仿2mL，再加入苯甲酰氯0.3mL，摇匀后于冰箱中4℃放置36h，使衍生化反应完全。挥干溶剂，残渣用甲醇稀释并定容至10mL量瓶中，微孔滤膜过滤，即得。

2.2 色谱条件

2.2.1 HPLC-ELSD内标法的色谱条件：色谱柱，ZORBAX EcliPse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm ID），流动相乙腈-水（32∶68），流速1mL/min，柱温35℃，蒸发光散射检测器，ELSD参数，喷雾器温度39℃，漂移管温度65℃，载气压力172.4kPa，增益值为200，进样体积20μL。色谱图见图1。

2.2.2 柱前衍生法的色谱条件：色谱柱，ZORBAX EcliPse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm ID），流动相是甲醇-水-四氢呋喃（90∶6∶4），流速1mL/min，柱温，30℃，检测波长，230nm，进样体积20μL。色谱图见图2。

图1 HPLC-ELSD内标法色谱图1.人参皂苷Rb2；2.黄芪甲苷Figure 1 HPLC-ELSD chromatograms of internal standard method1.Ginsenoside Rb2；2.AstragalosideⅣ

图2 黄芪甲苷提取物（A）及阴性样品（B）柱前衍生HPLC-UV色谱图*黄芪甲苷Figure 2 Precolumn derivatization HPLC-UV chromatograms of astragalosideⅣextract（A）and negative samPle（B）*AstragalosideⅣ

2.3 线性关系的考察

2.3.1 HPLC-ELSD内标法线性关系考察：精密吸取黄芪甲苷对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，分别置10mL量瓶中，精密加入内标溶液1mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，注入高效液相色谱仪，测得峰面积，以黄芪甲苷与人参皂苷Rb2的峰面积比y对浓度c作线性回归，得回归方程，y=1.284 5c+4.188 5，r=0.999 8；表明黄芪甲苷在0.028～0.281g/L内，进样浓度的自然对数和峰面积比值的自然对数呈良好的线性关系。

2.3.2 柱前衍生法线性关系考察：精密吸取黄芪甲苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置10mL量瓶中，用吡啶稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取对照品溶液0.5mL，加入氯仿2mL，再加入苯甲酰氯0.3mL，摇匀后于冰箱中4℃放置36h，使衍生化反应完全。挥干溶剂，残渣用甲醇稀释并定容至10mL量瓶中，摇匀，注入高效液相色谱仪，测得峰面积，以黄芪甲苷的峰面积y对浓度c作线性回归，得回归方程，y=5.720×106c-3.736×104，r=1.000 0；表明黄芪甲苷在0.056～0.336g/L内呈良好的线性关系。

2.4 精密度实验：取不同方法的同一供试品溶液，按各自方法的色谱条件重复进样5次，测定峰面积，结果表明，HPLC-ELSD内标法和柱前衍生法的相对标准差分别为2.11%和0.81%。表明柱前衍生法精密度要好于HPLC-ELSD内标法。

2.5 重复性实验：取同一供试品6份，按供试品溶液制备方法制备，按各自方法的色谱条件测定，结果表明，HPLC-ELSD内标法和柱前衍生法的RSD分别为2.26%和1.19%。表明柱前衍生法重复性要好于HPLC-ELSD内标法。

2.6 稳定性实验：取同一供试品溶液，按各自方法的色谱条件分别在0、4、8、12、16、24h检测，测定峰面积，结果表明，HPLC-ELSD内标法和柱前衍生法的相对标准差分别为3.37%和0.84%。表明柱前衍生法稳定性要好于HPLC-ELSD内标法。

2.7 加样回收率实验

2.7.1 HPLC-ELSD内标法加样回收率实验：精密称取黄芪甲苷提取物10.14mg，用甲醇溶解并定容至10mL量瓶中，精密量取样品溶液1mL，加入2mL量瓶中，共6份，分别加入浓度为0.478g/L的标准品溶液1mL。按照“2.1.2.1项”下制备供试品，按HPLC-ELSD内标法的色谱条件进行测定，计算回收率，结果HPLC-ELSD内标法的平均回收率为105.4%，相对标准差分别为3.90%。

2.7.2 柱前衍生法加样回收率实验：精密称取黄芪甲苷提取物13.00mg，用吡啶溶解并定容至50mL量瓶中，精密量取样品溶液2mL，共9份，分别加入3个浓度（0.224 32、0.280 40、0.336 48g/L）对照品溶液各3份。依次用吡啶溶液定容至5mL量瓶中。按照“2.1.2.2”项下制备供试品，按柱前衍生法的色谱条件进行测定，计算回收率，结果柱前衍生法的平均回收率为97.84%，相对标准差分别为2.14%。表明柱前衍生法加样回收率要好于HPLC-ELSD内标法。

2.8 样品含量测定：取3批黄芪甲苷提取物，按“2.1.2”项下方法操作制备供试品溶液。按“2.2”项下色谱方法进行测定黄芪甲苷的含量，测定结果见表1。

表1 3批样品中黄芪甲苷的测定结果Table 1 Determination of aStragaloSideⅣin 3 batcheS of SampleS（n=2，%）

3 讨 论

3.1 衍生条件的优化：本实验使用苯甲酰氯进行衍生化，在进行衍生化时要先加入氯仿，然后再加入苯甲酰氯，这样才能使衍生化完全。并考察了衍生化试剂的加入量、放置温度、放置时间等，结果衍生化试剂与样品的体积比为3∶5、放置在4℃中36h最好。

3.2 蒸发光散射检测参数的考察：对漂移管的温度进行了优化，在载气压力固定的条件下，温度从50℃～80℃每隔5℃测定一次，观察其信噪比。结果在漂移管温度为65℃，气体压力为172.4 kPa的条件下，黄芪甲苷有较小的噪音值和较高的信号相应值。

作为黄芪的标志性成分，黄芪甲苷的最大吸收波长为20nm左右，末端吸收较弱，同时提取物中干扰组分较多，采用HPLC常规的紫外检测器精密度准确度较低。蒸发光散射检测器检测灵敏度高，结果比较理想［7］。但其灵敏度检测器漂移管温度、蒸发湿度以及雾化气体流速等多种因素影响，仪器波动较大，相比于紫外检测器，稳定性和精密度较差［8-9］。特别是应用外标法测定时，对照品测定与样品测定过程间仪器状态的波动对结果准确度影响较大［10］。同时蒸发光散射检测器价值比较昂贵，应用范围较紫外检测器低。本实验比较了测定黄芪甲苷的2种方法，从实验结果可以看出，2种方法差异并无统计学意义，但是从2种方法的方法学考察结果表明，柱前衍生法在精密度、重复性、稳定性和加样回收率方面都优于HPLC-ELSD内标法。并且柱前衍生法简单易行，方法学验证符合要求，可作为黄芪药材及其制剂中黄芪甲苷成分定量的分析方法。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：284.

［2］李香华，王洪新.黄芪甲苷在心血管疾病中的作用［J］.心血管病学进展，2011，32（1）：132-136.

［3］辛颖，宋晓东，刘哲，等.HPLC-ELSD法测定欣力胶囊中黄芪甲苷的含量［J］.药物分析杂志，2008，28（4）：602-604.

［4］徐新军，胡海燕，王珊，等.高效液相色谱蒸发光散射检测器测定新血宝胶囊中黄芪甲苷含量［J］.药物分析杂志，2009，29（2）：292-294.

［5］李欢欣，郝桂明，赵春杰，等.反相高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.中国药学杂志，2003，38（3）：212-213.

［6］刘玮锦，蔡大可，刘亮锋，等.HPLC测定当归补血片中黄芪甲苷的含量［J］.药物分析杂志，2009，29（9）：1553-1555.

［7］王改香，朱智甲，林苗，等.柱前衍生反相高效液相色谱法测定黄芪中的黄芪甲苷［J］.分析实验室，2009，28（7）：108-110.

［8］王辰，侯连兵，刘婵.HPLC-ELSD法测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量［J］.中药材，2006，29（9）：618-619.

［9］纪松岗，李翔，朱东亮，等.高效液相色谱-蒸发光散射检测黄芪药材中黄芪甲苷的含量［J］.药学实践杂志，2005，23（5）：295-297.

［10］裴彩云，王宗权，贾继明，等.HPLC-ELSD内标法测定8个产地黄芪药材、饮片中黄芪甲苷的含量［J］.中国中药杂志，2011，36（14）：1982-1984.

（本文编辑：刘斯静）

A COMPARISON OF VARIOUS METHODS IN DETERMINATION OF ASTRAGALOSIDEⅣIN THE ASTRAGALOSIDEⅣEXTRACT

HOU Suyun，WANG Zongquan，JIA Jiming
（Department of Technology，Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Company Limited Solid，Shijiazhuang 050035，China）

ObjectiveTo comPare the difference of astragalosideⅣcontent in the astragalosideⅣextract by high Pressure liquid chromatograPhy-evaPortive light scattering detector（HPLC-ELSD）internal standard method and Precolumn derivatization HPLC resPectively.MethodsThe astragalosideⅣcontent in the astragalosideⅣextract was detected by HPLC-ELSD internal standard method and Precolumn derivatization HPLC resPectively.The Precision，rePeatability，stability and accuracy of the two methods and the diversity of astragalosideⅣcontent in different batches were comPared.ResultsThe determination results of HPLC-ELSD internal standard method and Precolumn derivatization HPLC are identical statistically.But Precolumn derivatization HPLC has advantages in Precision，rePeatability，stability and accuracy.ConclusionPrecolumn derivatization HPLC can control the quality of samPle better.

astragalus membranaceus；drugs，Chinese herbal；chromatograPhy，high Pressure liquid

R284.1

A

1007-3205（2012）05-0544-04

2011-12-25；

2012-02-01

侯素云（1980-），女，山东郯城人，石家庄以岭药业股份有限公司中级工程师，医学硕士，从事中药制剂工艺研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.05.018