α－L－岩藻糖苷酶的研究进展

2012-04-18黄丽君综述姚正国审校湖北省黄冈市黄州区人民医院检验科438000

检验医学与临床 2012年15期

黄丽君综述，姚正国审校（湖北省黄冈市黄州区人民医院检验科 438000）

α－L－岩藻糖苷酶（a－L－Fucosidase，AFU）是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中。1977年研究者在动物实验中观察到Morris鼠肝癌组织中AFU活力较正常肝脏高7倍，且与肿瘤生长期有关。1980年法国学者首先在3例原发性肝癌血清中发现AFU活性升高，并提出把AFU作为诊断肝癌的一种新的标志酶，并被后来的众多研究所证实。近年来，AFU检测的方法学研究，及肿瘤或非肿瘤性疾病的血清AFU水平变化的研究也日益增多，并且有不同的评价。

1 AFU的生物学特性

AFU是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体各种组织及体液中，如胎盘、胎儿组织、脑、肺、肝、胰、肾，以及血清、尿液、唾液、泪液等均含有AFU。其中以肝、肾等组织活性较高，细胞内的AFU主要位于溶酶体内。健康人血清AFU的相对分子质量达（270～390）×103，亚单位的相对分子质量为（56.0±2.8）×103和（54.0±2.7）×103，大约有8%左右的健康人血清AFU呈低活力。白细胞AFU的相对分子质量为（30～130）×103，肝脏 AFU的相对分子质量为（220～240）×103，亚单位的相对分子质量为（53.00±2.65）×103和（49.00±2.45）×103［1］。用神经氨酸苷酶处理后，血清AFU相对分子质量显著下降到（37±4）×103。而且他们在等电聚焦电泳中行为出现显著改变，在pH 3.8～5.9范围的酶活性基本消失，而在pH 6.0～7.2范围的酶活性增高。分子三级结构的改变和（或）较多唾液酸的聚集可能是AFU相对分子质量较大的原因。经过1%十二烷基硫酸钠（SDS）和5%巯基乙醇处理的血清、肝的AFU，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见2种相对分子质量十分接近的亚单位。

有资料显示，用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析纯化的人血清AFU同工酶显示出2条主带及5条细带；用蔗糖密度梯度层析法分析透析后的人血清AFU同工酶显示出8条同工酶区带，用Sephadex G200薄层等电聚焦及Aephadex G25柱等电聚焦分离AFU同工酶，可出现6条区带；用琼脂糖凝胶作为支持物做等电聚焦电泳，出现8条同工酶区带［1］。说明人体AFU分子根据其糖链组成与结构不同，可出现不同的同工酶表现形式，其原因可能与下列因素有关：（1）与结构基因有关；（2）与酶蛋白四级结构的差异有关；（3）与AFU分子中唾液酸含量有关。

AFU的反应特性：脑与肝AFU具有抗原一致性，用肝AFU制备的抗体IgG可与纯化的血清AFU发生免疫沉淀反应；血清AFU的反应最适在pH 4.8左右，在pH 6.1处可出现一个次要的“最适”pH峰，与脑、肝AFU的pH反应曲线类似，而且3者的Km值比较接近，提示血清和脑、肝AFU之间存在抗原特性和动力学特征的一致性。

2 AFU的测定方法

2.1 荧光法研究者利用AFU水解4－甲基伞型酮－α－L－岩藻吡喃糖苷释放4－甲基伞型酮，用碱性缓冲液终止反应，并使产物呈现荧光，用360nm或365nm激发波长和400nm或448 nm发射波长检测荧光强度，对照不同浓度4－甲基伞型酮制备的标准曲线求酶的活性，此法敏感性高，适用范围广。但该法对仪器条件要求高，不适合用于自动化检测。

2.2 终点比色法以对硝基苯酚α－L－岩藻糖苷为底物，在AFU催化下生成α－L－岩藻糖苷和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性溶液中呈黄色［2］，用分光光度计在405nm波长处检测。本法反应时间长，且操作较繁琐，干扰因素多，也不适用自动化检测。于秀艳等［3］对其进行了改进，利用对硝基酚毫摩尔消光系数为18.5的特性，根据AFU在pH 5.0的条件下催化对硝基苯－岩藻糖吡喃糖苷，生成对硝基酚和岩藻糖，在405nm波长下，对硝基酚有一吸收高峰，测其吸光度变化，不必做标准曲线，便可准确测出AFU含量。因本法采用因数两点法，可去除因溶血黄疸给试验带来的干扰。

2.3 速率法（连续监测法）血清中AFU催化2－氯－对硝基酚α－L－岩藻吡喃糖苷（CNP－F）水解生成2－氯－对硝基酚（CNP），在405nm或410nm波长监测CNP的生成速率，计算出AFU活性。本法测定对胆红素250mg／L、血红蛋白230mg／L、抗坏血酸6g／L无明显干扰［2］。该法操作简便，测定时间短，灵敏度和抗干扰性都有提高，适用于各种半／全自动分析仪器。依据底物的不同，速率法又可分为PNP法、CPNP法、MGCNPF法3种。PNP法底物为对硝基苯α－L－岩藻吡喃糖苷，灵敏度一般，对溶血、黄疸仍表现出一定的基质效应，精密度也较差。CPNP法采用氯化对硝基苯α－L－岩藻吡哺糖苷作底物，灵敏度和精密度较PNP法都有了很大的改善，但仍未完全解决溶血、黄疸及脂血的基质效应。MGCNPF为新型底物，灵敏度、精密度、抗干扰性及试剂稳定性都很高，是当前最为先进的检测方法。

3 AFU的临床意义

AFU是在20世纪70年代用于诊断一种AFU缺乏的遗传病，因先天缺乏AFU可以引起岩藻糖贮积病，对组织细胞、尿液和血清中AFU测定可协助该病的诊断，并借以与其他遗传性粘多糖贮积病鉴别。自1980年有研究者发现原发性肝癌患者血清AFU升高，并被后来的研究证实之后，国内外许多学者对AFU在临床应用方面进行了大量的探讨。从此，对AFU的临床意义有了全新认识。

3.1 原发性肝癌（primary hepatic cancer，PHC）近20多年来，有关AFU于肝癌的相关性研究众多。有资料表明，血清AFU对原发性肝癌诊断的阳性率在64%～84%之间，特异性在90%左右。血清AFU活性升高幅度和阳性率于AFP无相关性［4］。AFU血清水平和阳性率与肿瘤大小无关，病灶小于3cm的患者血清AFU升高的阳性率为70.8%～80.0%，明显高于AFP的阳性率（37.5%～40.0%）。何谦等［5］通过诱发大鼠肝癌的动物实验发现，AFP直到第18周肝癌演变期与健康对照组比较差异无统计学意义，而AFU从第14周早期肝癌形成期就与健康对照组比较差异有统计学意义，并且随着肝癌的动态发展过程进一步升高，从而证实AFU对原发性肝癌具有较高的诊断学价值。

3.2 肝炎和肝硬化大多数肝硬化和一部分乙肝患者的血清AFU活性均有不同程度的升高，可能与肝细胞损伤、酶逆流入血有关。乙肝患者血清AFU活性和血清ALT活性的升高程度具有高度的正相关。经抗肝炎治疗后，血清ALT活性下降，AFU活性也迅速下降，ALT活性持续不变或上升者，AFU活性也不下降。肝硬化患者血清AFU活性长期升高提示易发展为肝癌，或表示病情危险，或已有小病灶肝癌存在。所以血清AFU活性测定有助于乙肝病情发展的预测及肝硬化患者预后的观察［6］。

3.3 白血病曾有报道B细胞性慢性淋巴细胞白血病患者白细胞AFU活性明显低于其他类型白血病，并认为这与B细胞属性无关，而是恶性细胞的增殖产物。赵平等［7］报道，急性白血病患者血清AFU活性高于健康对照组，差异有统计学意义。M4、M5患者血清AFU活性与外周血单核细胞数的对数呈显著正相关，提示升高的血清AFU可能来源于单核细胞系统。

3.4 卵巢肿瘤洪开听等［8］测定101例妇科各型肿瘤患者及50例健康对照组AFU活性发现，90%的恶性卵巢肿瘤患者血清AFU活性明显低于妇科其他肿瘤及健康对照组，且与疾病分期、肿瘤负荷、组织学分型和肿瘤分化程度无关。恶性卵巢癌患者血清AFU活性降低可能与遗传因素有关。以275kU／L为临界值，据此诊断卵巢恶性上皮癌的敏感性和特异性分别为88.5%和98.5%。因此，AFU也可以作为卵巢癌的一个特异诊断指标。

3.5 健康孕妇樊国萍［9］测定了177例健康孕妇和69例健康未怀孕对照组的血清AFU活性，并将妊娠组按孕周数不同分为早孕组（1～12周）、中孕组（13～27周）、晚孕组（28～40周）。发现妊娠组与健康未怀孕对照组相比血清AFU水平升高差异有统计学意义（P＜0.01）；比较3组AFU水平发现晚孕组AFU水平高于早、中孕组（P＜0.01，P＜0.05），中孕组高于早孕组（P＜0.05），并伴随着妊娠周数的增加AFU水平呈升高趋势，在自然分娩或人工终止妊娠后迅速下降，5d后降至正常。因此，孕妇血清中AFU增高应视为妊娠过程中的特殊生理反应，不同于肝病时的升高，临床医生应加以区别。

3.6 糖尿病权翠侠等［10］对75例糖尿病患者和39例健康者进行了AFU活性测定，发现糖尿病患者AFU水平明显高于健康对照组，血糖控制差的糖尿病患者其AFU酶活力与同时测定的空服血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）存在显著正相关，而糖控制好的糖尿病患者组AFU酶活力与健康对照组差异无统计学意义，且与FBG和HbA1c不相关。说明糖尿病患者AFU升高与糖代谢控制的好坏有关，糖尿病患者血清AFU明显高于健康对照组，糖代谢控制差的患者血清AFU与FBG、HbA1c有显著正相关。这一结果说明糖尿病患者血清AFU可反映HbA1C和FBG所提示的糖代谢控制现状。

3.7 腹腔积液段俊林和欧超伟等［11］测定了128例各种病因引起的腹腔积液标本，并按照疾病性质将腹腔积液分成恶性腹腔积液组和良性腹腔积液组。结果显示，在恶性腹腔积液组中AFU活性均高于良性腹腔积液组，诊断敏感性为80.0%，特异性为87.3%，而且诊断准确率达83.6%，表明AFU活性检测可作为良、恶性腹腔积液鉴别诊断的一种较好标志物。

3.8 肺部疾病杨沛等［12］检测了临床诊断明确的肺部疾病患者97例，结果显示，除慢性阻塞性肺疾病患者血清AFU显著低于健康人及其他肺部疾病患者外，其他肺部疾病患者血清AFU均显著高于健康人。增高的原因可能与感染、免疫紊乱、蛋白质及脂质代谢异常，以及肿瘤的抗原性密切相关。说明AFU与肺部疾病的发生、发展有密切关系，对肺部疾病的诊断与鉴别诊断具有一定的临床价值［13－15］。

4 结语

综上所述，AFU在原发性肝癌的研究中正日益引起研究者的重视，并且在对肝炎、肝硬化、白血病、卵巢囊肿、糖尿病和肺部疾病的诊断与治疗，以及健康孕妇腹腔积液的相关检测中，AFU都有很高的应用研究价值。所以，继续探讨原发性肝癌患者组织和血清中AFU活性分布规律和升高机制，以及进行AFU同工酶的分离，制备出AFU的抗体及单克隆抗体，有可能使原发性肝癌得临床诊断与导向治疗提供更加有效的手段。

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