黎海莉，潘 莹，申 薇，杜 鹃，康 林*，崔慧先

（1.河北医科大学第四医院妇产科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学

基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄 050017）

·论 著·

单纯孕激素口服避孕药对大鼠催乳素水平及垂体催乳素细胞的影响

黎海莉1，潘 莹2，申 薇1，杜 鹃2，康 林2*，崔慧先2

（1.河北医科大学第四医院妇产科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学

基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄 050017）

目的探讨单纯孕激素口服避孕药左旋18-甲基炔诺酮（levonorgestrel，LNG）对大鼠垂体催乳素（prolactin，PRL）细胞形态以及血清浓度的影响。方法正常雌性SD大鼠分为长期给药组和停药组，应用免疫组织化学和透射电镜方法，观察大鼠垂体PRL细胞形态变化并检测PRL的血清浓度。结果长期给药组PRL免疫反应阳性细胞数目增多（P＜0.01）、面积增大（P＜0.05），血清PRL升高（P＜0.01），电镜下可见PRL细胞高尔基复合体发达、粗面内质网丰富，合成与分泌旺盛。停药后各项观察指标接近正常。结论应用LNG可引起大鼠垂体PRL细胞的形态、PRL的合成与分泌及血清PRL浓度的改变，但这一过程是可恢复的。LNG使血清PRL浓度升高，对排卵有一定抑制作用。

避孕药，口服，激素；垂体；催乳素；大鼠

单纯孕激素口服避孕药，对哺乳期妇女和想使用口服形式避孕的妇女，是一种很好的避孕方法选择［1］。目前，涉及下丘脑-垂体-卵巢轴反馈调节机制的研究报道，多集中于生殖药理学、生化学与临床研究方面，缺乏单纯孕激素避孕药对下丘脑-垂体-卵巢轴反馈调节的形态学资料。我们实验组一直致力于这方面的研究，在单纯孕激素避孕药左旋18-甲基炔诺酮（levonorgestrel，LNG）的长期作用下，可使大鼠下丘脑促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）阳性神经元形态发生改变，LNG使下丘脑GnRH神经元的功能处于非活跃状态［2］。下丘脑神经肽Y神经元、下丘脑弓状核的雌激素受体参与了LNG长期作用下GnRH分泌的调节［3］，在垂体水平，我们还证实LNG可逆性的反馈调节黄体生成素（luteinizing hormone，LH）细胞的形态［4］。由于催乳素（prolactin，PRL）水平的升高能使生殖机能减退，许多研究者观察了避孕药与高催乳素血症的关系。但是，迄今为止仍未取得一致的结果［5-6］。LNG是否通过影响垂体催乳素细胞而发挥其反馈调节作用尚未见报道。本文应用免疫组织化学、透射电镜等技术，在垂体水平探讨LNG对PRL细胞的形态及血清PRL浓度的影响，以期为临床避孕药物的应用提供形态学资料。

1 资料与方法

1.1 动物及分组：选用健康成年雌性SD大鼠23只，体质量200～250g（河北省实验动物中心提供），自然光照、室温（22±3）℃、自由饮食饮水饲养。大鼠随机分为实验组与对照组，实验组大鼠分为长期实验组7只（喂药90d）和停药实验组7只（停药后继续普通喂养20d）。实验组大鼠每天上午9时左右灌胃服用溶于食用麻油的LNG 50mg·kg-1· d-1，对照组（9只）灌服等量食用麻油。

1.2 取材及切片：依据阴道涂片结果，分别将处于动情期的实验组及其相应对照组的大鼠称质量，心脏取血后迅速使用4%多聚甲醛经主动脉行灌流固定，静置1h。所取心脏血样，室温下低速离心（2 000r/min）20min，-20℃备用待测。取垂体入Bouin液固定12h，常规脱水透明，石蜡包埋，用组织切片机从垂体头侧向尾侧做冠状连续切片，片厚4μm，切片裱于涂有多聚赖氨酸的载片上。每例垂体连续集片于10组载玻片（同一载玻片相邻2张切片间隔40μm）［4］，入37℃温箱内干燥24h，备用。

1.3 免疫组织化学法：常规石蜡切片脱蜡至水、依次进入0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4），3%过氧化氢（甲醇稀释）常温孵育，10%正常山羊血清、豚鼠抗大鼠PRL抗体（由协和医科大学提供，磷酸盐缓冲液1∶4 000稀释），4℃冰箱过夜。生物素标记的1∶100兔抗鼠IgG（由北京中山生物技术有限公司提供），37℃温箱、湿盒内孵育30min。1∶100辣根过氧化物酶的链霉卵白素（由北京中山生物技术有限公司提供），37℃温箱、湿盒内孵育30min。用DAB-H2O2显色3min，自来水停显，脱水，透明，中性树胶封固。

1.4 电镜取材及观察：实验动物断头后，迅速取其垂体，将其切成直径1mm的细块，浸入2.5%戊二醛磷酸缓冲液（pH 7.6）中室温固定48h，PBS冲洗，再入1%锇酸后固定1h，PBS冲洗，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，LKB-Ⅴ型超薄切片机切片，片厚约50nm。切片用枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色，日立H-7500型透射电子显微镜观察。

1.5 计算机图像分析：根据大鼠垂体冠状切面上，前叶、中间叶和后叶出现的形态学特征，每只大鼠分别在垂体头端部、中间部和尾端部选择典型切片［4］。应用ZL-2000型计算机图像分析系统在相应切片上测定单位视野内（0.01mm2）PRL细胞的个数及其面积，平均灰度和形状等参数。

1.6 血清PRL浓度测定：应用美国德普公司自动化学发光免疫分析仪（IMMULITE系统）及原装试剂盒测定血清PRL浓度［4］。

1.7 统计学方法：应用SAS8.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PRL细胞的免疫组织化学观察结果：大鼠腺垂体PRL免疫反应阳性细胞的胞质呈浅黄色，细胞形态呈不规则形，常单个分布于细胞索内，细胞多靠近毛细血管，或有细长突起至毛细血管附近（图1A）。长期实验组单位视野内PRL细胞个数为（2.68±0.35）个，多于长期对照组的（1.11±0.14）个，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1B，C）。停药实验组（1.39±0.19）个，同停药对照组（1.21± 0.13）个相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。停药实验组同长期实验组相比，细胞数目减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1D）。长期实验组PRL细胞面积为（156.85±22.66）μm2，大于长期对照组的（114.91±22.04）μm2，差异有统计学意义（P＜0.01）。停药实验组（126.16±22.64）μm2，同停药对照组（129.55±15.83）μm2相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。停药实验组同长期实验组相比，面积减小，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 腺垂体超微结构观察结果：PRL细胞的胞质内含有卵圆形或不规则形颗粒，直径500～700nm，胞质内还含有许多平行排列的粗面内质网、小泡及高尔基复合体。实验组大鼠PRL细胞呈合成与分泌旺盛的表现，细胞核核膜清晰，常染色质丰富；胞浆内分泌颗粒较少，颗粒大小不等，高尔基复合体发达，常围在一起，形成大圈状；粗面内质网丰富，常呈同心圆排列（图2）。

2.3 血清PRL浓度测定结果：长期实验组（18.62±3.84）mU/L同对照组（10.89±1.82）mU/L相比，血清浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。停药实验组（10.11±1.39）mU/L同对照组（11.74±1.94）mU/L相比，差异无统计学意义（P＞0.05），而同长期实验组相比，血清PRL浓度下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨 论

甾体避孕药的避孕机制是多环节的，其中抑制排卵是避孕作用的关键所在。正常的排卵依赖于下丘脑-垂体-卵巢轴的精密调控，其主要通过GnRH对LH和卵泡刺激素（follicle-simulating hormone，FSH）分泌的调控来实现［2-4］。但是，甾体避孕药对生殖过程的影响是综合性的，由于PRL水平的升高能使生殖机能减退。Shaaban等［7］发现使用Norplant埋植剂的妇女，半年后血清PRL升高。而Diaz等［8］对使用Norplant埋植剂妇女的血清PRL进行了纵向比较，并未发现显著差异。Spellacy等［9］观察到释放低剂量孕酮IUD可显著提高PRL水平，而含铜IUD却无此作用。Mishell等［10］发现长期和短期应用复方或单纯孕激素避孕药的妇女，血清PRL水平升高。但也有学者［11］观察到，低剂量雌二醇配伍LNG或地索高诺酮的复方片不影响血清PRL水平。迄今为止，这项研究仍未取得一致的结果。本实验中观察到，大鼠应用LNG后，长期实验组大鼠血清PRL升高，考虑PRL的升高参与了LNG对下丘脑-垂体-卵巢轴的调控作用。事实上，有报道［12］PRL可通过中枢及卵巢2条途径，对下丘脑-垂体-卵巢轴功能产生影响。PRL可作用于下丘脑-垂体轴，调控FSH的基因表达；高水平PRL可通过短路反射刺激下丘脑分泌多巴胺增多，抑制下丘脑GnRH的合成与释放，LH分泌下降，使机体不能形成排卵前的雌激素高峰和LH峰，并直接抑制卵巢合成雌二醇和孕酮，干扰受精和胚胎发育［13-15］。LNG是第2代全合成孕激素类药物，为19-去甲基-睾酮的衍生物，19位甲基被取代，17位增加乙炔基，是强有力的孕激素。本实验中观察到，大鼠应用LNG后，长期实验组大鼠垂体PRL细胞变大、数量增多。电镜下可见到胞浆内分泌颗粒减少，高尔基复合体发达，粗面内质网丰富，常呈同心圆排列。如此结果表明，PRL合成、分泌旺盛，使血清PRL浓度升高，这可能对抑制大鼠排卵起一定的作用。但是，由于基础PRL血清浓度的波动范围很大，并且其分布趋向于右斜，如果取血时间不同，加之实验对象年龄、种属的不同以及避孕药物组成和剂量的差异，都会使情况趋于复杂化，其具体机制有待进一步探讨。本实验观察到停药后，大鼠PRL细胞的形态、细胞分布与大小，都逐渐接近正常情况，血清激素浓度也逐步恢复正常水平。我们认为，应用LNG对腺垂体细胞形态和内分泌活动的影响是暂时的，停药后可恢复正常。实际上，长期应用避孕药的妇女，在停药后能恢复生育能力，这在临床上已得到验证。本实验从形态学等方面，进一步验证了这类药物的可恢复性。（本文图见封二）

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（本文编辑：刘斯静）

THE EFFECTSOF PROGESTIN-ONLY CONTRACEPTION ON THE PRL LEVEL AND THE MORPHOLOGICAL CHANGE OF THE PITUITARY PRL CELLS IN RATS

LIHaili1，PAN Ying2，SHENWei1，DU Juan2，KANG Lin2*，CUIHuixian2
（1.Department of Obstetricsand Gynecology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，
Shijiazhuang 050011，China；2.Departmentof Anatomy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the morphological alternations of prolactin（PRL）cells and the serum concentrations of PRL in levonorgestrel（LNG）-treated rats.MethodsThe normal female SD ratswere divided into long-term treated group and drug withdrawal group.The pituitary PRL cells were identified by immunohistochemistry and transmission electron microscope（TEM）method.The serum concentrations of PRL were measured by IMMULITE automated analyzer.ResultsIn long-term treated group，the number andmean areas of PRL cells increased（P＜0.01，P＜0.05）and the shape became irregular.Golgi complex and rough endoplasmic reticulum became very developed and the secretory granules with various size and shape decreased.The serum concentrations of PRL were significantly higher in treated group than those of control group（P＜0.01）.After drug-withdrawal，these observation indexes recovered to normal gradually.ConclusionLNG causes changes ofmorphology of PRL cells and concentrations of PRL，but these changes can return to normal after ceasing treatment.The antiovulation of LNG is various and complex and involve in the increase of the serum concentrations ofPRL.

contraceptives，oral，hormonal；pituitary gland；prolactin；rats

R979.21

A

1007-3205（2012）06-0621-04

2012-05-19；

2012-05-31

河北省科技厅博士基金课题（04547002D-3）

黎海莉（1974-），女，河北邯郸人，河北医科大学第四医院副主任医师，医学博士，从事生殖内分泌疾病以及妇科肿瘤诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.06.001