Caveolin-1在围植入期小鼠子宫内膜组织中的动态变化

2012-02-08王乾华

中国组织化学与细胞化学杂志 2012年5期

刘俊王乾华，2 周丽，3 汪琳＊

（1武汉大学基础医学院组织学与胚胎学教研室武汉430071；2华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科武汉430022；3河南省信阳市中心医院输血科信阳464000）

胚胎植入，又称着床，是囊胚经过定位、黏着后埋入子宫内膜的过程。胚胎植入的过程涉及一系列细胞信号转导机制，促进囊胚与子宫内膜之间的相互作用，最终使胚胎成功植入［1］。一直以来，国内外相关研究从不同的角度探讨参与胚胎植入的关键分子如黏附分子、细胞因子、植入相关基因、激素［2－6］等及其信号转导通路在调节滋养细胞侵袭、子宫内膜蜕膜化过程中的重要作用。细胞膜是信号转导的物质基础，Caveolae（胞膜窖）是细胞膜上直径为50－100nm的烧瓶状微内陷的膜性结构，富含有胆固醇和鞘磷脂，多见于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、巨噬细胞等。caveolae中富含多种与信号传导有关的受体、激酶及连接蛋白。Caveolins为21kDa～25kDa完整的膜蛋白，Caveolin-1（微囊蛋白-1）是Caveolins家族成员之一，是Caveolae的标志性结构蛋白。Caveolin-1具有异常拓扑结构，共有178个氨基酸残基构成。其中央102～134氨基酸残基形成疏水区，在caveolae膜结构上构成肝素样结构；N－末端1～101残基及C-末端的135～178氨基酸残基游离并伸入胞质内；而N－末端的残基82～101构成骨架区域（scaffolding-domain），是其功能域，能结合并失活caveolae膜内的多种信号分子，如 Ras、Raf、ERK、EGFR、eNOS［7－9］等，故caveolin-1被认为是“广谱”激酶抑制剂，处于各条信号通路交联的中心。本研究通过检测caveolin-1在围植入期小鼠子宫内膜组织中的表达，探讨caveolin-1与胚胎植入的相关性。

材料和方法

1.实验动物

选取健康成年雌性昆明小白鼠42只，体重23±3g，有规则的动情周期，饲养于明暗周期为12h的通风房间内，水食自取.采用随机分组方法将小鼠分为7组，每组按妊娠时间分为未孕组，妊娠3.5d，4.5d.5.5d，6.5d，7.5d和9d组（每组6只）.通过阴道脱落细胞图片法确定小鼠的动情期。后将处动情期的雌性小鼠下午16时-17时与雄性小鼠按1∶1的比例合笼，次日早上7时-8时检查阴道分泌物涂片，有精子者记为妊娠1d。

2.试剂和仪器

兔抗人多克隆抗caveolin-1抗体（SantaCruze公司），S-P超敏免疫组织化学试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒（中山公司），Total RNA Extraction Miniprep System 试剂盒（VIOGENE公司），RevertAidTM First Strand cDNA 合成试剂盒（Fermentas公司），引物合成（上海生工公司），PCR仪（BD公司）。

3.标本处理

将各组达到指定妊娠天数的小鼠处死，取出子宫组织，然后生理盐水内清洗，修剪结缔组织，剪取一部分置于4%的多聚甲醛固定，石蜡切片免疫组化备用，另一部分解剖显微镜下分离出子宫内膜，立即置于液氮中以备做RT-PCR。

4.免疫组织化学步骤

标本于4%的多聚甲醛固定24h，常规脱水、透明、石蜡包埋后切成4μm厚的切片，经脱蜡入水后蒸馏水洗3min×3次，PBS洗3min×3次，用枸橼酸缓冲液进行微波修复10min，恢复至室温后滴加3%过氧化氢溶液室温放置10min封闭内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3min×3次，PBS洗3min×3次；用正常山羊血清室温15min，封闭非特异性反应；甩掉多余血清，滴加按1∶100比例稀释的caveolin-1多克隆抗体（兔抗人，大鼠，小鼠），4℃过夜，PBS冲洗3min×3次；生物素标记的二抗羊抗兔IgG 37℃孵育20min，PBS洗3min×3次；滴加链霉抗生物素蛋白－过氧化物酶复合物37℃孵育20min，PBS冲洗3min×3次后进行DAB显色5～10min；冲洗后苏木素复染1～2min；常规脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替抗caveolin-1多克隆抗体孵育切片。采用HPIAS－2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对caveolin-1的表达进行定量分析，测定平均光密度值。

5.R T-PCR步骤

待每组每个时间点的6只小鼠取材完以后，提取妊娠子宫组织的总RNA，通过260nm／280nm吸光度比值测定提取RNA的纯度及含量。逆转录合成cDNA一链，PCR扩增caveolin-1的基因片断（引物序列参见表1）。反应体系为50μl：10×buffer 5μl（Fermentas），10mmol／l dNTP 1μl，cDNA 5μl，Taq酶2U，引物2μl，双蒸水补足反应体积。反应温度：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度55℃30s，72℃延伸30s，循环30次。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用BIO-RAD凝胶成像系统及半定量分析软件，以β-actin的表达量作为内参进行扫描分析mRNA条带的平均光密度，计算caveolin-1的mRNA相对量。

表1 caveolin-1的引物序列和PCR产物大小Table 1 The primer order and product size of caveolin-1

6.统计学分析

平均光密度和灰度扫描的结果均以均值±标准差（¯x±s）表示，所有结果应用SPSS 11.5统计软件作单因素方差分析和检验，检验水准α为0.05。

结果

1.免疫组织化学检测结果

Caveolin-1阳性反应为棕黄色，颗粒清晰，定位细胞膜和细胞浆。在围植入期子宫内膜（蜕膜）上皮、腺体上皮、蜕膜细胞中均有阳性表达，但表达的强度有差异：胚泡植入时（4.5d，5.5d，6.5d），Caveolin-1阳性产物表达最弱，而植入前（0d，3.5d），植入后（7.5d，9.5d），Caveolin-1阳性产物表达增强。将0d、3.5d阳性产物平均光密度值计为植入前期Caveolin-1蛋白的表达水平，4.5d，5.5d，6.5d计为植入期，7.5d，9d计为植入后期，各期计算平均值，植入期组与植入前期组、植入后期组比较，差异具有显著性（P＜0.05）；而植入前期组与植入后期组之间表达产物的阳性强度差异无显著性（P＞0.05）（见图1-7，表2）。

表2 早期妊娠小鼠子宫内膜组织中caveolin-1平均光密度的动态表达Table 2 The average optical density of the caveolin-1protein in the mice endometria

2.子宫内膜组织中caveolin-1的mRNA水平的变化

通过分析caveolin-1与内参β-actin的 mRNA条带平均光密度比值，胚泡植入时（4.5d，5.5d，6.5d），子宫内膜组织中Caveolin-1的mRNA水平较低；而植入前（0d，3.5d），植入后（7.5d，9.5d），子宫内膜组织中Caveolin-1的mRNA水平较高。将0d、3.5d 计为植入前期 Caveolin-1mRNA 表达水平，4.5d，5.5d，6.5d计为植入期，7.5d，9d计为植入后期，各期计算平均值，植入期组与植入前期组、植入后期组比较，mRNA表达水平差异具有显著性差异（P＜0.05）；而植入前期组与植入后期组之间mRNA表达水平无显著性差异（P＞0.05）。（见图8，表3）。

表3 早期妊娠小鼠子宫内膜组织中caveolin-1mRNA的相对表达量的变化Table 3 The relative expression of caveolin-1mRNA in the mice endomentria

讨论

哺乳动物的胚胎植入是生殖过程的一个关键环节，是妊娠的关键。包括受精卵定向地向子宫内迁移，与接受态的子宫内膜细胞进行对话，进而启动粘附、迁移、基质降解、侵蚀母体血管及新生血管生成等信号级联反应，生理性侵袭（physiological invasion）子宫内膜并增殖分化形成胎儿及其附属物。正常情况下，胚胎植入是胚胎与子宫之间时空上相互协调的过程，植入的成功必须具备许多条件，涉及一系列在囊胚与子宫内膜之间的最终使胚胎成功植入的信号转导机制，这一过程的调控机制十分复杂。

近年来关于caveolin-1的功能研究发现其与肿瘤的发生密切相关，体外实验证实caveolin-1能通过抑制凋亡，促进肿瘤细胞增殖；通过刺激肿瘤细胞的丝状伪足形成而促进侵袭转移；促进多药耐受形成等［10－11］。值得注意的是，自1829年 Lobstein等提出肿瘤的胚胎性起源概念以来，早期胚胎细胞与恶性肿瘤细胞生物学行为的相似性研究日益受到重视。Tera等［12－14］研究证实，早期胚胎细胞与恶性肿瘤细胞以及胚胎植入与肿瘤侵袭转移的生物学行为在病理生理过程、细胞增殖分裂、细胞凋亡、新生血管形成、免疫逃逸和侵袭性等诸多方面具有惊人的相似性。因此，本实验以caveolin-1为检测对象，检测其在围植入期子宫内膜组织中的动态表达变化，从而探讨胚胎植入的分子机制，期许可以有助于为肿瘤的发生、发展、侵袭转移的分子机理提供有意义的资料和信息。

本实验研究发现：caveolin-1在围植入期小鼠子宫内膜（蜕膜）上皮、腺上皮、蜕膜血管内皮组织中有阳性表达，并且在植入前，植入期和植入后的表达量在蛋白水平和mRNA水平均有差异，提示子宫内膜组织caveolin-1表达与胚胎在宫腔内的发育相关。植入可以认为是一种“同种异体移植的半抗原－胚胎”侵入子宫内膜的过程，是一个受到严格时空调控的精密的连续性过程，因此，caveolae／caveolin-1在胚胎围植入期不同阶段可能通过表达的上升和下降以调控不同的信号通路，并进而精确调控滋养层细胞对子宫内膜的有序侵袭。本实验结果表明：在植入前，子宫内膜组织高水平表达caveolin-1，其意义可能在于通过对细胞信号通路相关激酶的抑制作用，阻断早胚植入；在植入期，子宫粘膜上皮及基质细胞caveolin-1表达下降可能使细胞膜表面的激酶（如PTK、PKC、eNOS等）的活性部位释放，外源信号转导入胞内促进内膜上皮细胞的增殖、基质细胞的蜕膜化转变、基质内新生血管形成等，适应植入期滋养层细胞的侵袭及快速生长的需要。而在植入的后期，caveolin-1表达的上升可以抑制如PTK、PKC等通路的激活以保护作为“同种异体移植的半抗原－胚胎”细胞免受外界的影响，如机体免疫系统的攻击等，并有利于调控胚泡的适度植入。

本研究结果为寻找和确认控制“植入窗口”形成的关键分子提供新思路，同时可能为临床不孕、避孕、异位妊娠的防治和计划生育中抗植入提供重要理论基础。

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图版说明

图1 妊娠0d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示子宫内膜）免疫组化SP法 ×200

图2 妊娠3.5d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示子宫内膜）免疫组化SP法 ×200

图3 妊娠4.5d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示子宫内膜）免疫组化SP法 ×200

图4 妊娠5.5d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示蜕膜）免疫组化SP法 ×200

图5 妊娠6.5d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示蜕膜）免疫组化SP法 ×200

图6 妊娠7.5d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示蜕膜）免疫组化SP法 ×200

图7 妊娠9d组小鼠子宫内膜组织中caveolin-1的表达（↑示蜕膜）免疫组化SP法 ×200

图8 子宫内膜组织caveolin-1mRNA表达水平

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1The expression of caveolin-1in mouse endometria on 0 day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.2The expression of caveolin-1in mouse endometria on 3.5day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200