杜 江 张德军 王 勇 王运杰＊

（1中国医科大学附属第一医院神经外科，沈阳110001；2庄河市中心医院神经外科，庄河116400）

随着人口老龄化和平均寿命的延长，老年性痴呆发病率迅速攀升。血管性痴呆（vascular dementia，VD）是老年期痴呆的常见类型之一，是指缺血缺氧所引起的获得性智能损害综合征，是认知功能损害为特征的临床综合征，严重影响着患者的健康和生活质量［1］。脑内海马是学习、记忆的重要结构，大脑皮层及海马的神经元与人的学习记忆能力密切相关［2］。盐酸多奈哌齐（Donepezil），临床上主要用于治疗阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），能可逆性地抑制乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解，使直接参与神经传递突触间的乙酰胆碱含量增加，从而改善认知功能，近年的研究发现，盐酸多奈哌齐能够显著改善VD模型小鼠行为学成绩及海马病理学变化［3］，但是其药理作用机制还需进一步研究。细胞凋亡在缺血缺氧性脑损伤的发生发展中起重要作用，半胱天冬酶-3（Caspase-3）是caspase 级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种诱导因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用［4］，在神经系统中caspase-3不仅可以促进脑发育时期神经元的凋亡，还可以促进各种因素诱导培养的神经元凋亡，caspase-3可能是缺血缺氧神经元凋亡的重要效应分子［5］，但是其在血管性痴呆小鼠海马表达是否发生变化，盐酸多奈哌齐是否通过对其表达的调控参与VD大鼠学习记忆功能的改善和神经元突触可塑性的保护作用尚不清楚。因此，本实验采用双侧颈总动脉反复缺血－再灌注法制备VD小鼠模型，通过免疫组化和 Western blot方法检测caspase-3在VD小鼠海马的表达变化，利用跳台试验和水迷宫试验进行行为学测试，观察多奈哌齐对VD海马区caspase-3表达的影响，探讨多奈哌齐对VD的药理作用机制，从而为血管性痴呆的药物治疗提供理论和实验依据。

材料和方法

1.试 剂和仪器

兔抗小鼠caspase-3（购自Santa公司），羊抗兔IgG（购自中杉金桥生物技术有限公司）；S-P免疫组化染色试剂盒与DAB显色试剂盒（购自武汉博士德），小鼠水迷宫实验装置LW-Ⅱ型（中国医学科学院药物研究所），小鼠电刺激跳台仪（中国医学科学院药物研究所），盐酸多奈哌齐（卫材中国药业有限公司）。

2.动 物模型的建立及分组

90只雄性昆明小鼠，体重（30±5）g，购自中国医科大学实验动物部，随机分为假手术组、VD模型组和多奈哌齐治疗组，每组30只，采用双侧颈总动脉反复缺血－再灌注加尾端放血的方法［6］制备VD模型；假手术组作为对照，此组仅暴露双侧颈总动脉而不结扎，且尾部不放血；药物治疗组先制备模型，术后第2天经胃管给予盐酸多奈哌齐3mg／Kg／d，每天1次，共30d；假手术组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

3.学 习、记忆成绩测试

术后第29d，将各组存活小鼠分别进行跳台试验和水迷宫试验，测试学习成绩；术后第30d测试记忆成绩［7］。（1）跳台试验：测试装置为被动回避反应箱，记录小鼠首次受电击后跳上安全台所需时间（反应时间）、5min内跳下圆台次数（错误次数），作为学习成绩。24h后重复上述测试，记录小鼠首次从安全台跳至铜栅所需时问（潜伏时间）、5min内跳下圆台次数（错误次数），作为记忆成绩。（2）水迷宫试验：采用小鼠水迷宫试验装置，盲端有自动感应装置，自动控制记录仪记录数据。记录其游完全程时间、进入盲端次数作为学习成绩。24h后重复测试上述指标作为记忆成绩。

4.免 疫组化检测与观察

麻醉处死小鼠，取脑组织，用4%多聚甲醛进行固定，经乙醇脱水两次、二甲苯透明、石蜡包埋组织块，切片，片厚5μm，按SP试剂盒说明书测定caspase-3的表达，光学显微镜下仔细观察小鼠海马CAl区caspase-3的表达，同时将结果进行图像分析处理。

5.W estern blot检测与观察

麻醉处死小鼠，取脑组织，组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，4℃12 000r／min，离心30min，取上清，－80℃保存备用。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，蛋白样品经10%SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，兔抗小鼠caspase-3、β-actin（1∶500）孵育2h，羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育2h，暗室内ECL发光，X光片显影、定影，采用凝胶成像系统进行光密度测定并分析，以目的条带与内参照β-actin的平均光密度比值表示caspase-3蛋白表达水平。

6.统 计学处理

采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析，结果用¯x±s表示，单因素方差分析（one way ANOVA）进行组间比较，错误次数比较应用秩和检验，以P＜0.05为有显著性差异。

结 果

1.学 习、记忆成绩

跳台试验：VD模型组学习和记忆成绩均低于假手术组和多奈哌齐治疗组（P＜0.05），而多奈哌齐治疗组与假手术组间差异无显著性（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠跳台试验的学习和记忆成绩（¯x±s）Table 1 The comparison of the results of mice＇s learning and memory in step-down test in each group（¯x±s）

水迷宫试验：VD模型组的学习成绩和记忆成绩均低于假手术组和多奈哌齐治疗组（P＜0.05），而多奈哌齐治疗组与假手术组间差异无显著性（P＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠水迷宫试验的学习和记忆成绩比较（¯x±s）Table 2 The comparison of the results of mice＇s learning and memory in water maze test in each group（¯x±s）

2.免 疫组化检测海马caspase-3的表达

3组小鼠海马CAl区caspase-3阳性细胞数及平均光密度值比较：与假手术组（0.25±0.05）和多奈哌齐治疗组（0.27±0.04）相比，模型组CAl区caspase-3免疫反应阳性神经元数及阳性细胞平均光密度值（0.51±0.08）明显升高（P＜0.05），而多奈哌齐治疗组与假手术组间差异无显著性（P＞0.05），见图1。

图1 各组小鼠海马CAl区caspase-3的表达（×400）A：假手术组；B：VD模型组；C：多奈哌齐治疗组Fig 1.The expression of caspase-3in hippocampus CA1of mice in each group observed by immunochemistry（×400）A：Sham group；B：VD model group；C：Treatment group

3.W estern blot检测海马caspase-3的表达

3组小鼠海马caspase-3平均光密度值比较：与假手术组（0.12±0.02）和多奈哌齐治疗组（0.13±0.02）相比，模型组小鼠海马caspase-3平均光密度值与内参照β-actin平均光密度的比值（0.27±0.04）明显升高（P＜0.05），而多奈哌齐治疗组与假手术组间差异无显著性（P＞0.05），见图2。

图2 各组小鼠海马caspase-3的表达2A：假手术组；2B：VD模型组；2C：多奈哌齐治疗组Fig 2.The expression of caspase-3in hippocampus of mice in each group observed by wstern blot method 2A：Sham group，2B：VD model group；2C：Treatment group

讨 论

VD是指多次反复发作的各种脑血管病后逐渐出现的一种渐进性、阶梯型发展的认知功能障碍综合症，临床上往往以记忆障碍、人格缺损、人格改变、定向力丧失、行为异常、日常社交生活能力低下等为主要临床表现，严重影响着患者的健康和生活质量。盐酸多奈哌齐（Donepezil，1），化学名为2，3-二氢-5，6－二甲氧基-2-［（1-苄基4-哌啶基）甲基］-1H 一茚酮盐酸盐，是由日本卫材制药公司开发的第二代高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI），1997年首次在美国上市。本品对神经元乙酰胆碱酯酶有高度选择性，具有剂量小、半衰期长、不良反应小等优点，有研究对1219例轻、中度VD患者的2个随机对照研究和3090例VD患者的8个随机双盲安慰剂对照研究的系统回顾均显示，多奈哌齐对VD患者有改善作用［8］，多奈哌齐与尼莫地平联合治疗能明显改善老年期血管性痴呆患者的认知功能、日常生活能力及社会活动功能，且安全性好［9］，但是，多奈哌齐显改善血管性痴呆患者的认知功能的药理作用机制还不十分清楚。

脑内海马是学习、记忆的重要结构，大脑皮层及海马的神经元与人的学习记忆能力密切相关，血管性痴呆是由各种脑血管疾病引起的缺血缺氧而最终导致的获得性智能损害综合征，在这过程中海马细胞的凋亡扮演着重要的角色。细胞凋亡是由多因素引起，多分子参与的复杂过程，受多种蛋白分子调控，其中半胱天冬酶-3和Bcl-2水平的高低是细胞是否发生凋亡的决定性因素，半胱天冬酶-3是最重要的凋亡执行者之一，在凋亡执行阶段，负贵对全部或者部分关键蛋白进行酶切［10］，但是其在血管性痴呆小鼠海马表达是否发生变化，盐酸多奈哌齐是否通过对其表达的调控参与VD大鼠学习记忆功能的改善和神经元突触可塑性的保护作用尚不清楚。

本研究通过在术后第29天、第30天，通过跳台试验和水迷宫试验对各实验组小鼠进行行为学测试，发现盐酸多奈哌齐治疗组小鼠水迷宫找台潜伏期明显缩短，穿台次数明显增加，跳台试验的学习记忆能力明显改善，结果显示应用多奈哌齐治疗的VD小鼠表现为认知功能增强；与此同时，在应用免疫组化和western blot方法检测各组小鼠海马caspase-3的表达时发现，盐酸多奈哌齐治疗组小鼠海马的caspase-3的表达显著低于VD模型组，提示降低VD小鼠海马的caspase-3的表达很可能是盐酸多奈哌齐能够改善小鼠的学习、记忆功能的机制之一。

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