周敏 陈辉龙 程胜 梅丽 张惠兰 谢敏 熊维宁 徐永健

（华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，武汉430030）

黏液的过度分泌是慢性呼吸道疾病支气管哮喘的重要特征之一。气道被黏液栓阻塞，引起急性呼吸衰竭，是导致哮喘发病率和死亡率增高的主要原因。近年来的研究认为，气道上皮中大量杯状细胞增生和黏液蛋白Muc5ac的过度表达是哮喘黏液过度分泌的主要机制。众多哮喘动物模型研究认为，Th2型细胞因子白细胞介素IL-13，是诱导杯状细胞增生和Muc5ac过度表达的重要介质［1］。

AGR2（anterior gradient-2）蛋白最早于1998年首次发现并克隆，是肠道细胞产生黏蛋白MUC2所必需的［2］。它是一种功能尚不清楚的分泌型小分子，在乳腺癌、前列腺癌等一系列腺癌中都存在表达。最近有研究报道，AGR2蛋白可能参与哮喘小鼠气道黏液的过度分泌，而且作用与Muc5ac有关［3］。

本研究拟通过IL-13处理小鼠哮喘模型，检测小鼠肺组织AGR2mRNA及蛋白的表达以及Muc5ac蛋白的表达，了解IL-13处理前后AGR2表达的变化，探讨其在哮喘气道黏液过度分泌的作用。

材料和方法

1.实 验小鼠分组及哮喘模型的建立

6周龄SPF级雌性BALB／c小鼠（湖北省实验动物研究中心）18只，体重（20±2）g，随机分成正常对照组、哮喘组和IL-13组，每组6只。

1.1 哮喘组和IL-13组均在0d、7d、14d腹腔注射0.2ml含20μg卵蛋白（OVA，V级，Sigma公司）及2.25mg Al（OH）3的PBS溶液进行致敏，于21d－28d每天用1%OVA PBS溶液雾化吸入进行激发，每天一次，每次30min。

IL-13组在26d-28d每次激发前1h经鼻滴入含100μg重组小鼠IL-13（Pepro Tech公司，美国）的PBS溶液，体积为0.5ml／只。

1.2 对照组用PBS溶液代替OVA行腹腔注射及雾化吸入激发，其余无特殊处理。

2.支 气管肺泡灌洗及处理肺组织

各组小鼠最后一次激发24h后放血处死，在冰上分离结扎右主支气管，迅速切除右肺置于RNasefree的1.5ml离心管中，液氮中急冻，于-80℃保存，用于Real time-PCR测定。用生理盐水行支气管肺泡灌洗，注入0.4ml回抽，重复3次，获得支气管肺泡灌洗液（BALF）共约1ml。灌洗液回收置于高压灭菌的离心管中，置于-4℃冰箱，2h内作细胞分离。注入4%多聚甲醛0.3ml使左肺充盈，结扎气管并浸入4%多聚甲醛中固定，用于免疫组化测定。

3.B ALF细胞计数

BALF液体以200g离心5min，细胞沉淀用0.5mlPBS液体重悬，取0.1ml在细胞计数板上测定细胞总数，取200μl涂片，Wright-Giemsa染色，显微镜下观察300个细胞，进行嗜酸性细胞分类计数。

4.R eal time-PCR 检测肺 组 织 AGR2mRNA表达

采用Trizol试剂（美国Invitrogen公司），参照说明对各组肺组织总RNA进行提取。取2μg RNA逆转录（美国Invitrogen公司）cDNA，取2μlcDNA为模板，按照Takara公司试剂盒说明书在实时定量PCR仪（ABI Prism 7500HT）上进行检测，肌动蛋白β-actin为内参照，并设阴性对照。Real time-PCR 检 测 试 剂 盒 （SYBR Premix Ex Taq）购 自Takara公 司，AGR2 上 游 引 物 5-ATGAGTGCCCACACAGTCAA-3，下游引物5-GGACATACTGGCCATCAGGA-3；β-actin 上 游 引 物 5-CGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3，下游引物5－TGATCTCCTTCTGCATCCTGTCGG-3［4］。

5.免 疫组化法检测肺组织AGR2蛋白和Muc5ac蛋白表达

采用过氧化物酶标记的链霉卵白素（SP）染色法，即切片经常规脱蜡、水化后，用3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，微波抗原修复，其余步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。实验使用小鼠抗AGR2蛋白多克隆抗体（SANTA CRUZ公司），抗Muc5ac单克隆抗体（美国sigma），SP试剂盒和二氨基联苯（DAB）显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。AGR2抗体和Muc5ac抗体稀释浓度均为1：100阳性判断标准：高倍镜下，细胞胞浆呈棕黄色着染为阳性细胞。三组小鼠肺组织免疫组化染色图像经Image-Proplus WIN32图像分析系统进行蛋白表达强度半定量，测定5个视野的平均光密度。

6.统 计学处理

各指标以均数±标准差（¯x±s）表示，各组实验数据均用SPSS统计软件进行分析，以P＜0.05为差异有显著性。

结 果

1.三 组小鼠BALF中细胞总数和嗜酸性细胞分类计数比较（n＝6，¯x±s）

与正常对照组相比，哮喘组BALF中细胞总数、嗜酸性细胞分类计数水平明显增多，差异有显著性（P＜0.01）；用IL-13处理后，细胞总数、嗜酸性细胞分类计数明显升高（P＜0.01），见表1。

2.三 组小鼠肺组织AGR2mRNA表达结果

和正常对照组相比，哮喘组AGR2mRNA的表达（1.52±0.071）明显升高，差异有显著性（P＜0.05）。IL-13组与哮喘组相比，AGR2mRNA的表达（1.702±0.046）升高（P＜0.05），见图1。

表1 三组小鼠BALF中细胞总数和嗜酸性细胞分类计数比较（n＝6，¯x±s）Table 1 Cell counts and eosinophils percent in BALF of three groups（n＝6，¯x±s）

图1 三组小鼠肺组织AGR2mRNA表达水平的比较Fig.1The relative level of AGR2mRNA expression in lung tissue of three groups（n＝6，¯x±s）＊Compared with control，P＜0.01；＊＊Compared with Asthmatic group，P＜0.01

3.小 鼠肺AGR2和Muc5ac免疫组化染色结果

两种蛋白主要表达于气道上皮，阳性产物定位于细胞浆，Muc5ac蛋白在基底和肺泡表达弱，AGR2蛋白在肺泡有部分表达，见图2、3。

4.三 组小鼠肺组织气道AGR2和Muc5ac蛋白表达水平的比较

哮喘组Muc5ac和AGR2蛋白表达水平（0.535±0.054，0.505±0.078）与 正 常 对 照 组 （0.097±0.072，0.229±0.124）比较明显升高（P＜0.01），IL-13组 Muc5ac和AGR2蛋白表达水平（0.608±0.037，0.617±0.028）与哮喘组比较升高（P＜0.05）。表2 三组小鼠肺组织AGR2和Muc5ac蛋白表达水平的比较（n＝6，¯x±s）

Table 2 The expression of AGR2and Muc5ac protein in mice lung of three groups（n＝6，¯x±s）

＊Compared with control，P＜0.01；▲Compared with Asthmatic group，P＜0.05

5.哮 喘小鼠肺组织AGR2mRNA和蛋白表达与Muc5ac蛋白表达之间的相关性

经相关性分析表明，哮喘小鼠肺组织AGR2 mRNA表达水平与Muc5ac蛋白水平呈直线正相关（r＝0.862，P＜0.05），（见图4）。AGR2蛋白与的Muc5ac蛋白水平呈直线正相关（r＝0.847，P＜0.05），见图5。

图4 AGR2mRNA 与 Muc5ac蛋白相关性 Fig.4The relative level of AGR2mRNA and Muc5ac protein图5 AGR2蛋白与 Muc5ac蛋白水平相关性 Fig.5The relative level of AGR2protein and Muc5ac protein

讨 论

哮喘是由多种细胞，特别是T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞介导的慢性非特异性气道炎症，急性发作时黏液的大量分泌，伴有黏滞性增加，使得气道内黏液清除下降，引起阻塞，导致急性呼吸衰竭的发生。在参与哮喘黏液过度分泌的众多炎性介质与细胞因子中，以Th2型IL-13最具代表性，它能诱导气道杯状细胞增生，在引起哮喘气道黏液过度分泌中起关键作用。其作用与上调气道分泌型黏蛋白Muc5ac mRNA和蛋白的表达有关［1］，主要通过激活表皮生长因子受体EFGR实现［5］，机制复杂，涉及到STAT 6信号通路，Ras／MAPK通路、钙离子活化氯通道（CLCAs）等多个途径［6］。

分泌型小分子AGR2是一种胞浆内质网（ER）蛋白，分布非常广泛，最早于1998年由Thompson DA和 Weigel RJ［2］在乳腺癌中首次发现并克隆。近年来发现它在食管癌、乳腺癌、前列腺癌等众多腺癌细胞中高度表达，能促进肿瘤细胞的生长、迁移、转化，是一个潜在的肿瘤检测分子标记物。AGR2是肠道产生黏蛋白MUC2所必需的，与炎性肠病和肠道上皮功能相关［7］。

2012年［3］有研究者发现AGR2在哮喘小鼠肺组织表达升高，而下调AGR2的表达后气道分泌型黏蛋白Muc5ac表达减少。提示AGR2基因可能参与哮喘气道黏液的过度分泌。Yu H［8］等的研究中发现在下调气道上皮细胞IL-13表达过程中，同时伴有Muc5ac和AGR2表达水平的下降。

本研究中发现，哮喘小鼠肺组织AGR2mRNA和蛋白的表达水平均较正常水平增高，IL-13处理后明显促进了AGR2mRNA和蛋白的表达，并且表达水平与Muc5ac蛋白表达水平呈明显正相关。提示AGR2参与了哮喘气道黏液过度分泌，IL-13可通过上调其表达，进一步促进黏蛋白Muc5ac表达。

［1］Turner J，Jones CE.Regulation of mucin expression in respiratory diseases.Biochem Soc Trans，2009，37（Pt 4）：877-881

［2］Thompson DA and Weigel RJ.hAG-2 ，the human homo-logue of the Xenopus laevis cement gland gene Xag-2，is coexpressed with estrogen receptor in breast cancer cell lines.Biophys Res Commun，1998，251（1）：111-116

［3］Schroeder BW，Verhaeghe C，Park SW，et al.AGR2is induced in asthma and promotes allergen-induced mucin overproduction.Am J Respir Cell Mol Biol，2012Mar 8［Epub ahead of print］

［4］Wang Z，Hao Y，Lowe AW.The adenocarcinoma-associated antigen，AGR2，promotes tumor growth，cell migration，and cellular transformation.Cancer Res，2008，68（2）：492-497

［5］Zhen G，Park SW，Nguyenvu LT，et al.IL-13and epidermal growth factor receptor have critical but distinct roles in epithelial cell mucin production.Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36（2）：244-253

［6］Lai H，Rogers DF.New pharmacotherapy for airway mucus hypersecretion in asthma and COPD：targeting intracellular signaling pathways.J Aerosol Med Pulm Drug Deliv，2010，23（4）：219-231

［7］Ramachandran V，Arumugam T，Wang H，et al.Anterior gradient 2is expressed and secreted during the development of pancreatic cancer and promotes cancer cell survival.Cancer Res，2008，68（19）：7811-7818

［8］Yu H，Li Q，Kolosov VP，et al.Interleukin-13induces mucin 5AC production involving STAT6／SPDEF in human airway epithelial cells.Cell Commun Adhes，2010，17（4-6）：83-92